唐桂英 王芳 徐平麗 單雷

摘要：脂肪酸脫氫酶（FAD）能夠調(diào)節(jié)膜脂中不飽和脂肪酸的水平來提高植物對不良環(huán)境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法從花生中克隆到2個脂肪酸脫氫酶基因，命名為AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析結(jié)果顯示，2個基因的ORF區(qū)均為1 152 bp，編碼383個氨基酸；cDNA水平上有12個堿基差異位點，其中只有483位和720位的堿基差異引起氨基酸的改變；它們的基因組序列大小分別為5 089 bp和5 090 bp，在5′UTR區(qū)分別存在一個3 821 bp和3 822 bp的內(nèi)含子。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，這兩個基因為組成型表達，其中在葉片中的表達量最高，花和根中次之，莖與種子中表達量最低。低溫處理下，幼苗葉片中AhFAD2-2基因的表達量在0.5 h時迅速增加，至12 h達最高值，隨后表達量逐漸下降，說明AhFAD2-2的表達響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)。本研究結(jié)果可為花生的抗寒性遺傳改良提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：花生（Arachis hypogaea L.）；AhFAD2-2基因；低溫脅迫；基因表達

中圖分類號：S565.2：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0027-08

Abstract Fatty acid desaturase （FAD） can improve the stress tolerance of plants by regulating the contents of unsaturated fatty acids in membrane lipids. Two genes， named AhFAD2-2.1 and AhFAD2-2.2， encoding fatty acid desaturase were cloned from peanut by RT-PCR. Sequence analysis revealed that the ORF of both two genes were 1 152 bp， which encoded 383 amino acids. There were 12 different nucleotides between the two cDNA squences， among which， only the sites located at 483 and 720 lead to the differences at amino acid level. The gDNA sizes of the two genes were 5 089 bp and 5 090 bp， respectively. One 3 821-bp intron and one 3 822-bp intron were identified in the 5′UTR region of AhFAD2-2.1 and AhFAD2-2.2. The result of qRT-PCR showed that AhFAD2-2 was constitutively expressed， and the expression level was the highest in leaves， followed by flowers and roots， and the lowest in seeds. Under the low-temperature treatment， the expression level of AhFAD2-2 in peanut leaves increased significantly at 0.5 hour， reached the peak at 12 hour， and then decreased gradually. The results indicated that AhFAD2-2 might be responded to low temperature in peanut. This study could provide theoretical bases for the genetic improvement of cold resistance in peanut.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）； AhFAD2-2 gene； Low-temperature stress； Gene expression

低溫是限制植物分布，影響植物生長發(fā)育的重要因素。當環(huán)境溫度降低至不適宜植物生長的程度時，植物細胞中的不飽和脂肪酸含量及其組成會發(fā)生改變，以維持細胞膜的流動性和穩(wěn)定性，降低逆境對膜結(jié)構(gòu)的損害，增強植物抗寒性[1，2]。因此，研究植物細胞中不飽和脂肪酸的代謝，對于闡明植物的抗寒機制具有重要意義。

FAD2（fatty acid desatuase 2）是一種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Δ-12去飽和酶[3-5]，主要功能是催化單價不飽和脂肪酸C18∶1Δ9（油酸）在C12位脫氫，生成二價不飽和脂肪酸C18∶2Δ9，12（亞油酸）。大多數(shù)高等植物葉細胞中亞油酸（C18∶2Δ9，12）和亞麻酸（C18∶3Δ9，12，15）含量占脂肪酸總量的70%以上，非光合組織根與種子中所占比例也較高。盡管其他脂肪酸去飽和酶也參與了葉細胞中部分不飽和脂肪酸的合成，但大多數(shù)不飽和脂肪酸還是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的FAD2和FAD3催化合成，因此，F(xiàn)AD2一個最重要的功能是為整個植物體細胞中膜脂和儲藏脂的裝配提供所需的亞油酸，以及進一步去飽和產(chǎn)生亞麻酸[6]。研究發(fā)現(xiàn)，植物中存在兩類FAD2基因，一類主要在種子中表達，參與儲藏脂中脂肪酸去飽和；另一類為組成型表達，可能參與決定植物膜脂脂肪酸的不飽和程度，其活性對植物抗寒能力具有一定影響[7，8]。目前已經(jīng)在多種植物中分離出了FAD2基因，該基因受冷脅迫誘導(dǎo)。在低溫脅迫下，佛手香櫞葉的FAD2[9]、棉花葉的FAD2-3和FAD2-4[10]、油橄欖果實的FAD2-1和FAD2-2[7，11]及馬齒莧葉的FAD2-2的表達量隨著溫度的降低顯著升高[12]。在冷凍脅迫下，白楊PtFAD2過表達轉(zhuǎn)基因株系的存活率明顯比非轉(zhuǎn)基因株系和轉(zhuǎn)基因下調(diào)株系要高[13]。擬南芥fad2突變體缺乏脂肪酸脫氫酶活性，葉綠體膜中多不飽和脂肪酸含量顯著減少；在6℃條件下，植株生長受到抑制，最終枯萎、死亡[14]。

本研究克隆到兩個新的AhFAD2-2基因，并進一步利用qRT-PCR方法分析了它們在不同器官組織及在低溫脅迫下的表達情況，以期為該基因的功能及花生抗寒性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花生品種：魯花14號，由本實驗室保存，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學院飲馬泉試驗田，用于根、莖、葉、花與種子的取材；低溫處理的材料種植在花盆中，選生長3周、長勢一致的花生幼苗，于8℃條件下處理0（對照組）、0.5、1、4、12、24、48 h以及恢復(fù)常溫處理6 h和24 h，取葉片。所取樣品于液氮中速凍，置-80℃冰箱貯存，用于RNA或DNA提取。

1.2 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α（Escherichia coli）和pEASY-T3克隆載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑藥品

限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購自寶生物工程有限公司（大連）；2×TransTaq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix和TransStart Green qPCR SuperMix UDG購自全式金生物技術(shù)有限公司（北京）；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA分子量標準購自GENERAT生物技術(shù)有限公司（上海）；TRIzol Reagent 購自賽默飛世爾科技公司（上海）；PCR擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DNA序列測定由山東省農(nóng)業(yè)科學院測序中心完成；其余生化試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.4 AhFAD2-2基因的cDNA和gDNA克隆

以魯花14號幼嫩葉片為材料，分別利用Trizol 法和CTAB法[15]提取花生葉片總RNA和DNA；參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說明方法經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中ESTs拼接序列設(shè)計基因ORF（Open Reading Frame）區(qū)擴增引物AhFAD2-2orfF和AhFAD2-2orfR，及基因組擴增引物AhFAD2-2gDNA-F1和AhFAD2-2gDNA-R1（表1），PCR反應(yīng)體系：PCR Mix 10 μL，cDNA/gDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性30 s，59℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min（gDNA為5 min），30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析后，用膠回收試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-T3上，轉(zhuǎn)化并酶切驗證后送山東省農(nóng)業(yè)科學院測序中心測序。

1.5 AhFAD2-2基因的序列分析

利用http：//web.expasy.org/protparam/ 在線分析AhFAD2-2基因編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點；蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析和信號肽分析分別利用TMHMM2.0軟件http：//www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM/和Signal 4.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）進行。系統(tǒng)進化樹構(gòu)建利用MEGA5.0完成，采用Neighbor-Joining法，進行1 000次Boot-strap分析。

1.6 AhFAD2-2基因的表達模式分析

以花生根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期種子，以及不同時段低溫處理花生的葉片為材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，利用熒光定量PCR方法，以qRT-PCR-FAD2-2F1和qRT-PCR-FAD2-2R1為引物，以UBI2為內(nèi)參基因（表1），反應(yīng)體系采用TransStart Green qPCR SuperMix UDG說明書中20 μL體系，每個樣品3個技術(shù)重復(fù)。利用ABI 7500 PCR儀，采用2步法進行。反應(yīng)程序為：第一步95℃ 10 min；第二步95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。擴增曲線和Ct值由儀器自帶軟件自動生成。基因表達量的計算采用2-ΔΔCt方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhFAD2-2基因cDNA和gDNA克隆

以魯花14號葉片cDNA為模板，利用特異性引物AhFAD2-2orfF和AhFAD2-2orfR擴增到約1.1 kb的片段（圖1）。經(jīng)測序分析，獲得序列長度為1 152 bp的兩條cDNA序列，它們之間有12個堿基位點的差異，其中只有483位和720位的堿基差異導(dǎo)致了氨基酸水平上的不同。將其分別命名為AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。

以特異性引物AhFAD2-2gDNA-F1和AhFAD2-2gDNA-R1擴增AhFAD2-2基因的gDNA序列，得到一段約5 kb的產(chǎn)物（圖2）。經(jīng)測序分析，得到兩條長度分別為5 089 bp和5 090 bp的序列。

2.2 AhFAD2-2基因及編碼氨基酸序列分析

AhFAD2-2基因序列分析表明，兩基因ORF區(qū)均為1 152 bp，編碼383個氨基酸，推測相對分子量分別為43 839.27和43 829.29，等電點均為8.80。兩基因gDNA長度分別為5 089 bp和5 090 bp，5′UTR區(qū)分別包含一個3 821 bp和3 822 bp的內(nèi)含子。

利用NCBI網(wǎng)站中CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫對AhFAD2-2蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，AhFAD2-2蛋白中含有保守結(jié)構(gòu)域Membrance-FADS-like。此結(jié)構(gòu)域為FAD超家族所共有的，推測該蛋白是FAD家族成員（圖3）。

以TMHMM2.0分析AhFAD2-2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在49～71、81～103、176～198、223～243和250～272氨基酸處存在著5個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖4），且每兩個結(jié)構(gòu)域之間的距離較短。通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)AhFAD2-2蛋白結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。利用SignalP 3.0軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽結(jié)構(gòu)，推測AhFAD2-2編碼的蛋白質(zhì)不是分泌蛋白。

運用PROSITE數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)花生FAD2-2氨基酸序列的105～111、141～147位和315～321位有3個高度保守的組氨酸簇，分別為HECGHH、HRRHH、HVAHH（圖5）。研究表明，在FAD2家族中，這3個組氨酸簇是FAD2蛋白發(fā)揮功能必不可少的活性位點，同時還被預(yù)測為鐵原子的配體。相鄰組氨酸簇之間的距離也是一定的，這一特點在其他物種FAD2蛋白中也存在[16]。

將AhFAD2-2氨基酸序列與已知的其他物種FAD2氨基酸序列進行比對，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹（圖6）。植物中FAD2基因主要分為兩類，一類是組成型表達的FAD2，一類是種子特異性表達的FAD2。不同物種FAD2氨基酸序列分析顯示，與花生AhFAD2-2聚在一支的均屬于組成型表達的FAD2。其中，AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2分別與來源于B基因組和A基因組的野生種花生FAD2-2親緣關(guān)系最近；其次與大豆GmFAD2-2（Glycine max，L29215）、棉花GhFAD2-2（Gossypium hirsutum，Y10112）和檸條錦雞兒CkFAD2（Caragana korshinskii，ABP49577.1）的親緣關(guān)系較近，而與擬南芥AtFAD2（Arabidopsis thaliana，NP_187819.1）、油菜BnFAD2（Brassica napus，AAF78778.1）、向日葵HaFAD2（Helianthus annuus，OTG00389.1）親緣關(guān)系相對較遠?；ㄉ鶤hFAD2-2與AhFAD2A、AhFAD2B聚在不同分支，后者屬于種子特異性表達FAD2，說明AhFAD2-2是不同于花生AhFAD2A和AhFAD2B的另一類基因。

2.3 AhFAD2-2基因表達分析

以UBI2為內(nèi)參基因，對AhFAD2-2基因在根、莖、葉、花、不同發(fā)育時期種子以及低溫處理不同時段葉片中的表達模式進行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示，在花生的根、莖、葉、花和種子中均有AhFAD2-2基因表達，但在不同組織中表達量有所差異。葉中的表達量最高，其次是花和根，在莖和種子中該基因的表達量最低（圖7）。并且發(fā)育前期種子內(nèi)表達量明顯高于后期（圖8）。推測花生AhFAD2-2基因編碼的蛋白可能在膜脂的脫飽和代謝中發(fā)揮作用。

低溫脅迫的葉片中，處理0.5 h時AhFAD2-2表達量迅速升高，隨著處理時間的逐漸延長，表達量逐漸增加，處理12 h時表達量最高；之后表達量表現(xiàn)為下降趨勢，但在48 h后表達量明顯高于對照未處理組?；謴?fù)常溫后表達水平略微降低（圖9）。表明AhFAD2-2顯著響應(yīng)低溫脅迫處理。

Gm：大豆Glycine max；Ck：檸條錦雞兒Caragana korshinskii；Mt：苜蓿Medicago truncatula；Ca：鷹嘴豆Cicer arietinum；Ah：花生Arachis hypogeae； Ai：野生花生Arachis ipaensis；Ad：野生花生Arachis duranensis；Cc：木豆Cajanus cajan；Tm：旱金蓮Tropaeolum majus；Hb：風車藤Hiptage benghalensis；Rc：蓖麻Ricinus communis；Pt：毛白楊Populus tomentosa；Lu：亞麻Linum usitatissimum；Pl：芍藥Paeonia lactiflora；So：菠菜Spinacia oleracea；Po：馬齒莧Portulaca oleracea；Pc：荷蘭芹Petroselinum crispum；Cp：Crepis palestina；Ct：紅花Carthamus tinctorius；Vg：斑鳩菊Vernonia galamensis；Ha：向日葵Helianthus annuus；Co：金盞花Calendula officinalis；Oe：油橄欖Olea europaea；Vf：油桐Vernicia fordii；Pg：石榴Punica granatum；Gh：陸地棉Gossypium hirsutum；Mp：水黃皮Millettia pinnata；Pam：鱷梨Persea americana；Bo：琉璃菊Borago officinalis；At：擬南芥Arabidopsis thaliana；Bc：埃塞俄比亞芥Brassica carinata；Bj：芥菜型油菜Brassica juncea；Bn：油菜Brassica napus；Br：蕪菁Brassica rapa。

3 討論與結(jié)論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，許多植物中存在多個拷貝的FAD2基因，且不同拷貝具有不同的表達模式，可將它們分為組成型表達和種子特異性表達兩類[17]。如向日葵HaFAD2-1和大豆FAD2-1A、FAD2-1B在發(fā)育的種子中特異表達，而HaFAD2-2、HaFAD2-3和大豆FAD2-2為組成型表達，由此推測它們在不同部位的表達與功能是密切相關(guān)的[18，19]。在紅花中發(fā)現(xiàn)的11個拷貝的FAD2基因也驗證了這一推測[20]。目前，本課題組在花生中克隆到4個拷貝的FAD2基因，分別是AhFAD2（AhFAD2A和AhFAD2B）以及AhFAD2-2（AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2）。AhFAD2A和AhFAD2B主要在種子中表達，參與花生種子儲藏脂中不飽和脂肪酸的合成[21]。本研究中克隆到的AhFAD2-2，在系統(tǒng)進化樹中與AhFAD2A和AhFAD2B聚在不同分支，距離較遠；而與組成型表達的一類基因聚在一起，其中該分支中研究較多的大豆GmFAD2-2、棉花GhFAD2-2的表達響應(yīng)低溫脅迫，可能參與膜脂不飽和脂肪酸的合成。說明AhFAD2-2是花生中新的一類脂肪酸去飽和酶FAD2。

植物通過脂肪酸去飽和酶引入雙鍵，調(diào)節(jié)生物膜膜脂不飽和脂肪酸的水平，改變生物膜的流動性，從而響應(yīng)并適應(yīng)低溫環(huán)境。大量研究證明，膜脂脂肪酸不飽和度主要取決于FAD的種類和數(shù)量[17]。油菜硬脂酰ACP去飽和酶（stearoyl-ACP desaturase）基因SAD受低溫誘導(dǎo)后表達量顯著升高，冬性抗寒品種SAD上調(diào)幅度明顯高于春性冷敏感品種[22]。大豆中FAD2-2C基因的表達量明顯受到低溫環(huán)境的影響，生長在溫度較低條件下大豆的FAD2-2C表達量比對照提高了8倍[23]。Kargiotidou等對棉花組成型表達基因FAD2-3和FAD2-4研究時發(fā)現(xiàn)，這兩個基因的表達水平均受低溫脅迫誘導(dǎo)，并且葉片中二價不飽和脂肪酸的種類與含量也顯著增加[10]。將番茄的LeFAD3基因超表達，4℃處理的轉(zhuǎn)基因番茄幼苗中，LeFAD3基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅升高，葉和根中C18∶3顯著增加，C18∶2顯著降低，且葉綠體膜系統(tǒng)中的超微結(jié)構(gòu)比對照完整性好，PSⅡ最大光合效率也明顯高于對照[24]。這些研究表明，脂肪酸脫氫酶在植物低溫脅迫響應(yīng)中起重要作用。本研究中AhFAD2-2的表達增強與低溫脅迫具有明顯相關(guān)性，推測該基因參與花生抗寒反應(yīng)，但其抗低溫脅迫的機制仍需進一步深入研究。

參 考 文 獻：

[1] 林萍， 齊力旺， 汪陽東， 等. 植物抗寒工程中脂肪酸去飽和酶研究進展[J]. 分子植物育種，2006，4（3）： 404-410.

[2] 年洪娟， 陳麗梅. 不飽和脂肪酸在逆境脅迫中的作用[J]. 中國微生態(tài)學雜志， 2012， 24（8）： 760-762.

[3] 李金金， 張晶晶， 年洪娟. Δ12-脂肪酸去飽和酶FAD2的基本特性及其在脅迫中的功能[J]. 生命科學研究， 2013， 17（2）： 174-178.

[4] Wu P Z， Zhang S， Zhang L， et al. Functional characterization of two microsomal fatty acid desaturases from Jatropha curcas L. [J]. Journal of Plant Physiology，2013，170（15）： 1360-1366.

[5] Dyer J M， Mullen R T. Immunocytological localization of two plant fatty acid desaturases in the endoplasmic reticulum [J]. FEBS Letters， 2001， 194（1/2）： 44-47.

[6] Okuley J， Lightner J， Feldmann K， et al. Arabidopsis FAD2 gene encodes the enzyme that is essential for polyunsaturated lipid synthesis[J]. Plant Cell， 1994， 6： 147-158.

[7] Hernández M L， Padilla M N， Sicardo M D， et al. Effect of different environmental stresses on the expression of oleate desaturase genes and fatty acid composition in olive fruit[J]. Phytochemistry， 2011， 72（2/3）： 178-187.

[8] Esteban A B， Sicardo M D， Mancha M， et al. Growth temperature control of the linoleic acid content in safflower （Carthamus tinctorius） seed oil[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（2）： 332-336.

[9] Yang L， Ye J， Guo W D， et al. Differences in cold tolerance and expression of two fatty acid desaturase genes in the leaves between fingered citron and its dwarf mutant[J].Trees， 2012， 26（4）： 1193-1201.

[10]Kargiotidou A， Deli D， Galanopoulou D， et al. Low temperature and light regulate delta 12 fatty acid desaturases （FAD2） at a transcriptional level in cotton （Gossypium hirsutum） [J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（8）： 2043-2056.

[11]Matteucci M， DAngeili S， Errico S， et al. Cold affects the transcription of fatty acid desaturases and oil quality in the fruit of Olea europaea L. genotypes with different cold hardiness [J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（10）： 3403-3420.

[12]Teixeira M C， Coelho N， Olsson M E， et al. Molecular cloning and expression analysis of three omega-6 desaturase genes from purslane （Portulaca oleracea L.） [J]. Biotechnology Letters， 2009， 31（9）： 1089-1101.

[13]Zhou Z， Wang M， Zhao S， et al. Changes in freezing tolerance in hybrid poplar caused by up-and down-regulation of PtFAD2 gene expression [J]. Transgenic Research， 2010， 19（4）： 647-654.

[14]Lemieux B， Miquel M， Somerville C， et al. Mutants of Arabidopsis with alterations in seed lipid fatty acid compositon[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1990， 80： 234-240.

[15]梁雪蓮， 鄭奕雄， 陳曉玲， 等. 花生DNA提取方法比較[J].生物技術(shù)， 2007， 17（1）： 41-44.

[16]Los D A， Murata N. Structure and expression of fatty acid desaturases[J]. Biochim Biophys Acta， 1998， 1394（1）： 3-15.

[17]戴曉峰， 肖玲， 武玉花， 等. 植物脂肪酸去飽和酶及其編碼基因研究進展[J]. 植物學通報， 2007， 24（1）： 105-113.

[18]Heppard E P， Kinney A J， Stecca K L， et al. Developmental and growth temperature regulation of two different microsomal omega-6 desaturase genes in soybeans[J]. Plant Physiology， 1996， 110（1）： 311-319.

[19]Martínez-Rivas J M， Sperling P， Lühs W， et al. Spatial and temporal regulation of three different microsomal oleate desaturase genes （FAD2） from normal-type and high-oleic varieties of sunflower （Helianthus annuus L.）[J]. Molecular Breeding， 2001， 8（2）： 159-168.

[20]Cao S J， Zhou X R， Wood C C， et al. A large and functionally diverse family of FAD2 genes in safflower （Carthamus tinctorius L.）[J]. BMC Plant Biology， 2013， 13： 5.

[21]周麗俠， 唐桂英， 陳高， 等. 花生AhFAD2基因的多態(tài)性及其與籽粒油酸/亞油酸比值間的相關(guān)性[J]. 作物學報， 2011， 37（3）： 415-423.

[22]Tasseva G， De Virville J D， Cantrel C， et al. Changes in the endoplasmicreticulum lipid properties in response to low temperature in Brassica napus[J]. Plant Physiol. Biochem.， 2004， 42： 811-822.

[23]Schlueter J A， Vasylenko-Sanders I F， Deshpande S， et al. The FAD2 gene family of soybean[J]. Crop Science， 2007， 47（S1）： 14-26.

[24]Yu C， Wang H S， Yang S， et al. Overexpression of endoplasmic reticulum omega-3 fatty acid desaturase gene improves chilling tolerance in tomato[J]. Plant Physiol. Biochem.， 2009， 47： 1102-1112.