鄒文康

【摘 要】冷凍電鏡技術(shù)已經(jīng)成為解析生物大分子結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力手段，并且在相關(guān)領(lǐng)域取得矚目的成績。介紹了冷凍電鏡的基本原理以及發(fā)展歷程，最后對冷凍電鏡的發(fā)展應(yīng)用進(jìn)行了初步的探討。

【關(guān)鍵詞】冷凍電鏡；透射電鏡；高分辨結(jié)構(gòu)

一、引言

北京時(shí)間2017年10月4日，2017年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)最終授予了Richard Henderson、Joachim Frank和 Jacques Dubochet三位科學(xué)家，以表彰他們在發(fā)展冷凍電鏡技術(shù)中所作出的杰出貢獻(xiàn)。冷凍電鏡廣泛應(yīng)用于研究生物大分子結(jié)構(gòu)，由于該技術(shù)能夠快速、高效、精確地解析復(fù)雜的生物大分子結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在已經(jīng)逐漸成為檢測生物大分子結(jié)構(gòu)的主流手段。

二、冷凍電鏡的基本原理

冷凍電子顯微鏡技術(shù)（cryo-electron microscopy，cryo-EM），簡稱冷凍電鏡，是利用快速冷凍的技術(shù)冷凍生物大分子后，在低溫中用透射電子顯微鏡對樣品進(jìn)行成像，最后通過圖像處理獲得樣品三維結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)，基本步驟包括制備冷凍樣品、電子顯微鏡二維成像、計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理并重構(gòu)三維結(jié)構(gòu)等。

通常將水冷凍時(shí)往往會形成冰晶，而冰晶會影響顯微鏡對樣品的成像過程，并且會破壞樣品本身的結(jié)構(gòu)，因此，在冷凍電鏡中采用快速冷凍的方式使水處于無定形的玻璃態(tài)水，如圖1所示。制備冷凍樣品一般是將樣品在特定的濕度和溫度中利用特殊載體包裹，并放入經(jīng)液氮浴冷卻的液態(tài)乙烷罐中快速形成玻璃態(tài)的水，最終獲得冷凍樣品。并且與一般樣品相比，冷凍樣品在抗電子輻射的時(shí)間和輻射量上有所提高；電子作用于樣品時(shí)，樣品分子也不容易發(fā)生漂移，并且背景襯度也有所改善。

冷凍電鏡成像的基本原理為：首先由電子槍發(fā)射電子束沿著真空通道照射到樣品上，透過樣品的電子可能出現(xiàn)折射或者反射等不同情況，樣品致密處透過的電子少，疏松處則透過的電子多；然后電子束被物鏡會聚并放大，最終投射到屏板上，獲得圖像，如圖2所示。舉個(gè)例子，比如用手電筒照射裝有水晶的玻璃球，光線通過放大鏡放大映在墻壁上出現(xiàn)影子，即電子束是手電筒的光束，冷凍樣品是裝有水晶的玻璃球，最終的投影就是電鏡中獲得的二維圖像。而投影中有較暗的地方說明水晶較厚，反之則薄，類比于冷凍電鏡中也是一樣的。

由于樣品之中各個(gè)分子的朝向各不相同，從屏板上能夠獲得成千上萬的二維圖像。接著計(jì)算機(jī)根據(jù)樣品顆粒的方向、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行解析分類，并且應(yīng)用相關(guān)軟件進(jìn)行三維重構(gòu)最終得到生物大分子的完整三維結(jié)構(gòu)，如圖3所示。

三、冷凍電鏡的發(fā)展歷程

生物大分子通常需要穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮生物功能，所以要想更好地研究生物大分子的功能，其中非常重要的是能夠了解其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。一般生物大分子的尺寸都在幾個(gè)納米到幾十個(gè)納米之間，光學(xué)顯微鏡已經(jīng)無法觀察到生物大分子的結(jié)構(gòu)。于是，科學(xué)家們想到用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。透射電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的原理相似，是利用電子束穿透樣品，電子碰到樣品后發(fā)生折射等情況，然后電子通過電子透鏡放大成像從而得到圖像，如圖1所示。由于電子的波長僅為光波的十萬分之一左右（波長越小，能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的最短間距越?。?，所以理論上電鏡是可以獲得納米級的分子結(jié)構(gòu)。

但是，傳統(tǒng)透射電子顯微鏡因?yàn)楦鞣N原因難以應(yīng)用于生物樣品，比如，透射電子顯微鏡需要樣品在高真空環(huán)境下進(jìn)行檢測，而生物樣品中有水分，在高真空環(huán)境下，水的沸點(diǎn)降低容易揮發(fā)； 電子束的高能量在穿透樣品時(shí)容易將樣品損毀，例如維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的氫鍵僅需很低的能量就會斷裂；電子穿過有活性的樣品時(shí)，有可能使得樣品漂移，無法清晰成像； 電子作用于樣品與背景后得到的明暗程度差別不大，襯度較低，獲得的圖像不清晰。隨著上述問題不斷改善，冷凍電鏡應(yīng)運(yùn)而生。

1968年，Klug A等人提出獲得三維物體不同方向的二維圖像后，在計(jì)算機(jī)中進(jìn)行重構(gòu)得到樣品三維結(jié)構(gòu)的理論。1974年，Taylor K A等人使用透射電子顯微鏡成功對冷凍的樣品進(jìn)行成像，至此冷凍電鏡誕生。而三位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者又在不同的方面發(fā)展了冷凍電鏡：1982年，Jacques Dubochet等人發(fā)現(xiàn)了水的玻璃態(tài)并應(yīng)用于制備冷凍樣品；1990年，Richard Henderson等人成功使用冷凍電鏡解析出高度有序的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)，這也是第一次應(yīng)用冷凍電鏡解析出的膜蛋白結(jié)構(gòu)；1995年，Joachim Frank等人成功運(yùn)用自己的算法解析出大腸桿菌核糖體的三維結(jié)構(gòu)。

冷凍電鏡技術(shù)逐漸成熟，并且在近些年中飛速地發(fā)展，圖像分辨率不斷提高，其中也依賴許多新技術(shù)的出現(xiàn)。第一，由于電子探測器的發(fā)明，冷凍電鏡無需像從前一樣先將電信號轉(zhuǎn)化為光信號再轉(zhuǎn)化回電信號才能得到圖像，而是直接探測電子數(shù)量甚至在利用互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）感光元件使得探測器能在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)十張投影圖像，再通過后期處理提高了圖像的清晰程度；第二，石墨烯應(yīng)用于冷凍樣品的制備中，使得包裹樣品的冰層更薄，能夠更好地解析樣品結(jié)構(gòu)；另外，計(jì)算軟件的不斷優(yōu)化更新，使得成像時(shí)間更短，重構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)也更精密、更清晰。

目前，冷凍電鏡與X射線晶體學(xué)和核磁共振在解析和獲得生物大分子結(jié)構(gòu)中起到了至關(guān)重要的作用。然而，另外兩種方法都具有一些局限性，比如，X射線晶體學(xué)只能對有序的三維結(jié)晶進(jìn)行檢測而大多數(shù)蛋白分子難以結(jié)晶，核磁共振則需要樣品顆粒足夠小并且解析圖譜的限制比較多。基于以上原因，冷凍電鏡技術(shù)成為了解析生物大分子的重要工具。

四、應(yīng)用與展望

目前，冷凍電鏡已經(jīng)成功應(yīng)用于解析各種生物大分子。2013年，加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）程亦凡和David Julius的研究組首次得到膜蛋白TRPV1（如圖4所示）的3.4埃（1埃等于0.1納米）近原子級別高分辨率三維結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著冷凍電鏡解析進(jìn)入原子分辨率時(shí)代。隨后一段時(shí)間內(nèi)，許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜、對稱度低、分子量的蛋白質(zhì)分子也逐漸被解析，例如剪接體、乳酸脫氫酶等。

五、結(jié)束語

冷凍電鏡技術(shù)目前仍有許多發(fā)展空間，例如應(yīng)用于藥物研發(fā)，通過解析疾病相關(guān)靶標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)，以此開發(fā)、合成高特異性的藥物或者抑制劑；也可用于解析細(xì)胞中的生物大分子原位的三維結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)等，探索未知的生物活動(dòng)過程。亦或從本身技術(shù)方面切入，例如，開發(fā)其他樣品載體以改善樣品質(zhì)量，更好地維持樣品原有的生物活性；改進(jìn)和優(yōu)化圖像處理軟件算法，開發(fā)更精準(zhǔn)的二維和三維分類工具以高效構(gòu)建圖像。

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