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新生兒高膽紅素血癥(neonatal hyperbilirubinemia)是新生兒期常見的疾病之一。近些年其發(fā)病率高達(dá)30%～50%，占新生兒住院原因的首位[1]。如果病情重且治療不及時，可造成神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如聽力障礙、運(yùn)動障礙及智力低下等，甚至死亡。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌組織細(xì)胞胞漿內(nèi)，近些年來人們逐漸認(rèn)識到NSE可作為高膽紅素血癥腦損傷的早期檢測指標(biāo)[2]。依達(dá)拉奉(edaravone)是一種腦保護(hù)劑，現(xiàn)已被應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中[3-4]。但依達(dá)拉奉應(yīng)用于高膽紅素血癥腦損傷的研究國內(nèi)外鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察新生SD(sprague-dawley)大鼠高膽紅素血癥時使用依達(dá)拉奉干預(yù)后各時間點(diǎn)腦組織病理變化及血清中NSE水平的變化，探討依達(dá)拉奉對高膽紅素血癥新生大鼠有無神經(jīng)保護(hù)作用，為依達(dá)拉奉在新生兒高膽紅素血癥腦損傷的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 晶體膽紅素，購自美國Sigma公司；鼠NSE ELISA試劑盒，購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；依達(dá)拉奉注射液(商品名：易達(dá)生，20 mL∶30 mg)，由吉林省博大制藥有限責(zé)任公司提供。

1.2 動物分組 選擇7 d齡SD大鼠72只，將其隨機(jī)分為3組：高膽紅素血癥組、依達(dá)拉奉干預(yù)組、正常對照組，每組24只。每組又隨機(jī)分為3個亞組：12 h組、24 h組、48 h組，每個亞組8只。

1.3 動物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 膽紅素的配制 在避光條件下稱取40 mg的晶體膽紅素，立即溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中，再加入雙蒸水9 mL，用0.5 mol/L的HCl調(diào)至pH8.5，并保證于1 h內(nèi)使用。

1.3.2 新生大鼠高膽紅素血癥模型的制備 參照文獻(xiàn)[5]，采用腹腔注射的方法，高膽紅素血癥組以及依達(dá)拉奉干預(yù)組新生大鼠按100 μg/g的劑量注入膽紅素1次，建立高膽紅素血癥動物模型。正常對照組新生大鼠腹腔注入等體積的生理鹽水1次。依達(dá)拉奉干預(yù)組在造模后立刻給予新生大鼠依達(dá)拉奉2 mg/(kg·d)腹腔注射，持續(xù)2 d。

1.4 標(biāo)本的獲取與實(shí)驗(yàn)

1.4.1 血清標(biāo)本 分別于各時間點(diǎn)用5%的水合氯醛將新生SD大鼠麻醉，行心臟采血，置于管中，離心取血清，于-80 ℃冰箱保存，隨后用酶聯(lián)免疫的方法檢測各組血清NSE水平。

1.4.2 腦組織標(biāo)本 取血之后灌注生理鹽水和甲醛溶液，之后斷頭取腦組織，于10%甲醛溶液中固定1 d后石蠟包埋，行石蠟切片，置于載玻片上，HE染色，隨后封片，顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織病理學(xué)觀察 正常對照組HE染色海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，無明顯細(xì)胞水腫；高膽紅素血癥組可見海馬區(qū)細(xì)胞排列略紊亂，細(xì)胞水腫明顯；依達(dá)拉奉干預(yù)組于各個時間點(diǎn)腦組織病理變化較高膽紅素血癥組輕。詳見圖1～圖3。

HE染色 12 h(100×) HE染色 24 h(100×) HE染色 48 h (100×)圖1 正常對照組腦組織病理學(xué)觀察

2.2 血清NSE含量 高膽紅素血癥組12 h、24 h、48 h血清NSE水平均高于依達(dá)拉奉干預(yù)組、正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；依達(dá)拉奉干預(yù)組12 h、24 h、48 h血清中NSE水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常對照組12 h、24 h、48 h血清中NSE含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時間血清NSE比較(±s) ng/mL

3 討 論

NSE主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌組織細(xì)胞胞漿內(nèi)。有研究表明，血漿NSE是在非侵入條件下可量化神經(jīng)元損傷程度的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)標(biāo)志物[6]。近年來，動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NSE水平與高膽紅素血癥腦損傷密切相關(guān)[7-8]。Akman等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥聽力損傷嬰兒血清NSE水平有增高趨勢。國內(nèi)研究也認(rèn)為，血清NSE可作為高膽紅素血癥腦損傷的標(biāo)志物，并可判斷腦組織損傷的嚴(yán)重程度[2，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射膽紅素造模12 h后，血清NSE水平增高，24 h、48 h進(jìn)一步增高。高膽紅素血癥組12 h、24 h、48 h血清NSE水平均較正常對照組明顯增高(P<0.05)，與Bortolussi等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。其原因可能是高膽紅素血癥時，血清中膽紅素通過血-腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)元腫脹、變性、壞死等，進(jìn)而神經(jīng)元胞質(zhì)中表達(dá)的NSE漏出至腦脊液、血液中，隨著神經(jīng)元損傷的逐漸加重，外周NSE水平逐漸增高。

依達(dá)拉奉是一種腦組織保護(hù)劑。Itoh等[11]及Munake等[12]的研究證實(shí)依達(dá)拉奉有明確的神經(jīng)保護(hù)作用。依達(dá)拉奉的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化[13]、抑制血管痙攣[14]等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。劉霄等[15]研究顯示，依達(dá)拉奉可減少腦缺血損傷病人血清中NSE含量，有助于腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)對24只高膽紅素血癥新生大鼠進(jìn)行依達(dá)拉奉干預(yù)，發(fā)現(xiàn)干預(yù)后12 h、24 h、48 h血清NSE水平較高膽紅素血癥組明顯降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉對高膽紅素血癥新生大鼠有腦保護(hù)作用，然而依達(dá)拉奉干預(yù)組血清NSE水平仍高于正常對照組，可能是依達(dá)拉奉干預(yù)2 d后仍有不同程度的腦損傷，尚未完全修復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為依達(dá)拉奉可以降低高膽紅素血癥新生大鼠血清NSE水平，對高膽紅素血癥新生大鼠有腦保護(hù)作用。然而依達(dá)拉奉對高膽紅素血癥腦損傷的修復(fù)機(jī)制尚不明確，依達(dá)拉奉的兒童用量、療程、不良反應(yīng)等方面尚需要進(jìn)一步研究。