陳光侯，熊勝利，李 平，陳大芳，謝玲玲，任麗群，李 波，王 欽，龍清孟，冉雪琴

（1.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽 550018；2.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

斷奶前后仔豬腹瀉是生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的一種常見疾病，而且死亡率很高，直接影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)報(bào)道，在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國家，如瑞典、英國和丹麥，新生仔豬腹瀉病的發(fā)生率分別為75.0%、50.5%和36.6%[1-3]。我國仔豬腹瀉病的發(fā)生率也很高，2012年對(duì)國內(nèi)某省4 118個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)戶進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率高達(dá)18.31%、死亡率在10.44%~57.01%之間不等[4-5]。早年在豬流行性腹瀉病毒還沒大量報(bào)道之前，我國仔豬腹瀉病的發(fā)生率全年平均高達(dá)46.5%[6]，個(gè)別地區(qū)甚至更高。近年來更是出現(xiàn)豬流行性腹瀉病毒和腸毒素大腸桿菌（ETEC）混合感染導(dǎo)致仔豬大面積腹瀉發(fā)生和死亡的事件。研究表明，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli F4,ETEC F4）是引發(fā)斷奶前后仔豬腹瀉病的最主要致病菌[7-8]。F4為大腸桿菌ETEC的菌毛類型之一，分為F4ab、F4ac及F4ad，其中分布最廣泛的主要血清型是F4ac[9]。研究表明ETEC的F4ab、F4ac候選受體為MUC13（跨膜黏蛋白），主要是在胃腸道上皮表面[10-11]。

多年來，貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心一直致力于開展國外引進(jìn)種豬選種選育研究，尤其是抗性新品系的培育工作及推廣應(yīng)用研究。種豬場(chǎng)在世代選育中采用了抗腹瀉基因檢測(cè)技術(shù)，保留腹瀉抗性有利基因GG型個(gè)體，組建核心群種豬抗腹瀉新品系，建立大約克種豬抗腹瀉選育示范點(diǎn)?；A(chǔ)豬群采耳樣組織，送往江西農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)研究，結(jié)果表明大約克種豬在MUC13基因腹瀉抗性等位基因GG的頻率為16.79%（23/137），G基因頻率為0.46，腹瀉易感不利等位基因A基因頻率為0.54[12-13]，這一檢測(cè)結(jié)果表明，利用分子育種技術(shù)輔助育種，兼顧選留表型和生產(chǎn)性能優(yōu)秀個(gè)體，逐世代加大GG純合抗性個(gè)體的選留比例，逐步淘汰AA和GA易感基因型個(gè)體，可使得育種群中有利基因頻率提高，最終建立抗K88（F4ac）腹瀉專門化品系。中心開展了大約克種6個(gè)不同基因型的組合配種方案：GG♂×GG♀、GG♂×GA♀、GA♂×GA♀、AA♂×GG♀、AA♂×GA♀、AA♂×AA♀，在相同的飼養(yǎng)環(huán)境條件下，跟蹤觀察其哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率、腹瀉致死率、其他原因致死率、斷奶成活率，結(jié)果表明不同組合選配所生仔豬在哺乳期間的腹瀉發(fā)生率相應(yīng)為 2.71%、26.44%、46.18%、30.32%、40.96%、44.14%；不同組合選配其后代腹瀉致死率相應(yīng)為 0、3.07%、6.49%、3.94%、11.65%、12.5%；不同組合選配其哺乳仔豬其他原因致死率相應(yīng)為0.78%、1.92%、2.67%、1.97%、4.42%、5.08%；其斷奶成活率分別為 99.22%、95.02%、90.84%、94.09%、83.94%、82.42%[13]。由此可見，利用分子技術(shù)輔助選育進(jìn)行ETEC F4ac腹瀉抗性有利基因GG型個(gè)體選育，組建種豬抗腹瀉基礎(chǔ)群（新品系），可以從種源上提高種豬質(zhì)量，從而最大限度控制規(guī)?；i場(chǎng)新生仔豬及斷奶前后仔豬腹瀉的發(fā)生率，挖掘斷奶仔豬提高成活率的潛力，對(duì)提高豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效率和國外引進(jìn)種豬的使用價(jià)值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心課題組人員在科研試驗(yàn)場(chǎng)挑選46頭大約克種豬為研究群體，于2017年6月13日采耳樣組織，進(jìn)行腹瀉基因檢測(cè)，明確基因型。2017年7月中旬，將大約克種豬按照3個(gè)不同組合（GA♂×GG♀、GG♂×GG♀、GA♂×GA♀）進(jìn)行選配，對(duì)不同組合生下的后代進(jìn)行后備種豬初選。2018年1月18日對(duì)仔豬進(jìn)行耳組織采樣，每頭豬采1份耳組織，開展抗腹瀉基因的個(gè)體選育研究。耳組織2~3 g，于75%乙醇的離心管中-20℃低溫保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA，提取試劑盒制備基因組DNA，作為PCR檢測(cè)的模板。

1.2 主要驗(yàn)儀器設(shè)備

①離心機(jī)（Avanti-J30I），美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)；②制冰機(jī)（banshen），美國Grant公司生產(chǎn)；③凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；④熒光定量PCR儀（MyCycler），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；⑤標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)（SW-CJ-IFD），上海錦星科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；⑥電泳儀（DYY.III2穩(wěn)壓電泳儀），北京六一儀器廠生產(chǎn)；⑦-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司生產(chǎn)；⑧水浴恒溫鍋（SHZ-82），中國金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的豬MUC13基因序列設(shè)計(jì)4條特異性的引物（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR 反應(yīng)體系為 10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各 0.5 μL，基因組 DNA（100 ng/μL）1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足 10 μL 體積。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃/63℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果

將電泳得到173 bp條帶定為A基因，83 bp條帶定為G基因，如只得到1條173 bp條帶的樣品定義為AA基因型，只得到1條83 bp條帶的樣品定義為GG基因型，如得到2個(gè)條帶即為雜合的AG基因型（圖1）。

圖1 GG基因型（左）和AA基因型（右）

2.2 克隆測(cè)序

將得到的173 bp和83 bp兩種條帶分別切膠回收，連接T-載體，送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行基因克隆測(cè)序，證實(shí)擴(kuò)增片段確為MUC13基因，位于內(nèi)含子7當(dāng)中，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，依據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型為G或A。

2.3 基因型頻率和基因頻率

試驗(yàn)從豬場(chǎng)的基礎(chǔ)繁殖群中挑選46頭大約克種豬為研究對(duì)象，開展基因檢測(cè)，明確其腹瀉相關(guān)基因型，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，本次檢測(cè)的基礎(chǔ)群46頭大約克（40頭母、6頭公），檢出抗腹瀉基因型GG個(gè)體12頭（2頭公豬，10頭母豬），腹瀉易感基因型GA個(gè)體為34頭（30頭母豬、4頭公豬），腹瀉易感基因AA型個(gè)體為0，其基因型頻率與基因頻率見表3。

表2 基礎(chǔ)繁育群抽檢的46頭大約克（母豬40頭、公豬6頭）抗腹瀉基因型

表3 46頭大約克豬的基因型頻率及基因頻率

試驗(yàn)將已明確基因型的母豬與公豬，采用3種不同基因型進(jìn)行組合選配：①GA♂×GG♀組合方式配 3產(chǎn)（即分別對(duì)應(yīng) 1、2、3窩）；②GA♂×GA♀組合方式配 3產(chǎn)（分別對(duì)應(yīng) 4、5、6窩）；③GG♂×GG♀組合方式配2產(chǎn)（分別對(duì)應(yīng)7、8窩）。保育期結(jié)束（仔豬滿雙月齡）時(shí)，根據(jù)豬場(chǎng)豬群血統(tǒng)、系譜實(shí)際情況，確定預(yù)留后備豬仔豬。預(yù)留仔豬查看分娩記錄，包括窩產(chǎn)仔數(shù)、初生重、斷奶重，觀察仔豬乳頭對(duì)數(shù)是否達(dá)到7對(duì)、要求乳頭對(duì)稱、無發(fā)育不良的奶頭，公豬睪丸發(fā)育是否良好、睪丸是否對(duì)稱，仔豬體重及體型外貌表現(xiàn)是否優(yōu)秀等情況，初步預(yù)留后備豬。本研究是在傳統(tǒng)選育的基礎(chǔ)上，對(duì)初步預(yù)留的后備仔豬，采耳組織樣，開展抗腹瀉基因檢測(cè)，目的是選留腹瀉抗性有利基因型GG個(gè)體作為后備豬，最終組建抗腹瀉新品系。本次對(duì)8產(chǎn)（8窩）選留的60頭預(yù)留后備豬仔開展抗腹瀉基因型檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表4 大約克種豬不同配種方案后代抗腹瀉基因檢測(cè)結(jié)果與分析

續(xù)表4 大約克種豬不同配種方案后代抗腹瀉基因檢測(cè)結(jié)果與分析

本研究按照GG♂×GG♀組合選配2窩，其后代預(yù)選留（隨機(jī)挑選）的16頭仔豬，進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，結(jié)果均為抗腹瀉有利基因GG型個(gè)體，有利基因型檢出率100%，說明大約克種豬按照GG♂×GG♀組合選配，所生的仔豬均為抗腹瀉GG個(gè)體。這一結(jié)果與熊勝利等、龍清孟等對(duì)杜洛克豬群、加系大約克豬群的抗腹瀉基因研究基本一致[14-15]。

從表4可知，預(yù)留的60頭大約克后備豬仔豬，抗腹瀉基因GG型個(gè)體24頭（12頭母豬、12頭公豬），腹瀉易感基因GA型個(gè)體31頭（20頭母、11頭公），腹瀉易感基因AA型個(gè)體5頭（3頭母豬、2頭公豬），其基因型頻率、基因頻率見表5。

表5 選留的60頭大約克后備豬抗腹瀉基因的基因型頻率和基因頻率

3 討論

3.1 建立大約克種豬抗腹瀉新品系選育思路

抗性育種是種豬育種發(fā)展的重要方向，優(yōu)質(zhì)抗病種豬新品種（系）的培育是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，傳統(tǒng)的常規(guī)選育技術(shù)難以獲得有效的遺傳進(jìn)展。參考前人的研究結(jié)果，結(jié)合抗腹瀉基因檢測(cè)輔助選育，總結(jié)分析一個(gè)豬場(chǎng)要開展腹瀉抗性新品系選育時(shí)，首先最好把該豬場(chǎng)的核心群、基礎(chǔ)繁育群的公母全部采樣，進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，明確核心群種豬、基礎(chǔ)繁育群不同個(gè)體的基因型。

3.2 組建抗腹瀉種豬基礎(chǔ)群（包括種公豬及種母豬）

根據(jù)抗腹瀉基因檢測(cè)結(jié)果，可組建核心群種豬（原種豬群）腹瀉抗性基因GG型群體，或抗腹瀉基因GG型基礎(chǔ)繁育群。

3.3 根據(jù)系譜，開展不同組合基因型公母選配

（1）最佳組合選配方案為GG♂×GG♀。選用該組合選配方式，其所生的后代均為腹瀉抗性GG型個(gè)體，直接根據(jù)血統(tǒng)需要選留體型外貌、生產(chǎn)性能等優(yōu)秀的個(gè)體作為后備種豬進(jìn)行擴(kuò)繁，最終建立大約克抗腹瀉新品系，這是最直接最理想的選育方案。

（2）其次考慮 GA♂×GG♀、GG♂×GA♀兩種組合選配，其后代在選留后備豬時(shí)，采樣進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，最終選留腹瀉抗性GG型個(gè)體。

本研究根據(jù)生產(chǎn)需要，把生產(chǎn)性能、體型外貌都表現(xiàn)優(yōu)秀的腹瀉易感基因GA型先保留下來，按照GA♂×GG♀，進(jìn)行組合選配，從其F1代中選出符合種用的預(yù)留后備種豬21頭，并采耳組織樣進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，檢出GG型個(gè)體8頭，GG型個(gè)體檢出率 38.1%（8/21）。

按照GA♂×GA♀組合選配，從F1代中選留符合種用的預(yù)留后備仔豬23頭，進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，結(jié)果抗腹瀉有利基因型個(gè)體GG檢出率為0，說明按照該組合選配，其所生的后代抗腹瀉基因GG型個(gè)體檢出率低。

因?yàn)楸狙芯坎皇遣捎谜C仔豬都檢測(cè)，而是只針對(duì)符合后備種豬預(yù)留條件的仔豬進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，只能說明GA♂×GG♀組合其后代GG型個(gè)體的檢出率高于GA♂×GA♀組合選配的。要深入了解GA♂×GG♀與GA♂×GA♀組合選配其所生仔豬的有關(guān)腹瀉基因型分配情況，這有待于進(jìn)一步深入研究，需要整窩仔豬采樣檢測(cè)，并且擴(kuò)大檢測(cè)窩數(shù)。

（3）最后考慮按照GG♂×AA♀、AA♂×GG♀方案進(jìn)行組合選配。

在實(shí)際生產(chǎn)中，尤其在純種繁育場(chǎng)，必須充分考慮血統(tǒng)、系譜、繁殖性能、兼顧體形外貌等指標(biāo)，因此，保全種豬場(chǎng)血統(tǒng)、系譜需要的前提下，必須盡可能保留繁殖性能較為優(yōu)秀的GA、AA基因型個(gè)體，再按照GG♂×AA♀、AA♂×GG♀方案進(jìn)行組合選配，對(duì)符合后備種豬選用條件的F1代、F2代、甚至F3代進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，最終選留其抗腹瀉后代，再逐步淘汰腹瀉易感型基因GA型、AA型的父母本。可見選育多個(gè)血統(tǒng)純種大約克抗腹瀉新品系所需的時(shí)間更長。

3.4 種豬腹瀉抗性新品系建立后導(dǎo)入新的血緣，擴(kuò)大抗腹瀉基因型個(gè)體的最佳組合選配面

在純種繁育場(chǎng)保全血統(tǒng)、系譜完整、已建立健全抗性新品系基礎(chǔ)群的前提下，通過引種導(dǎo)入新血緣，避免重蹈閉鎖選育的覆轍。

首先將新引進(jìn)的新血緣個(gè)體，進(jìn)行抗腹瀉基因檢測(cè)，明確引進(jìn)群體的基因型情況。其次再根據(jù)優(yōu)先組合選配原則，最先考慮GG♂×GG♀組合選配方案，其次考慮GA♂×GG♀、GG♂×GA♀兩種組合選配。

3.5 雜交利用

抗性新品系核心群組建后，開展不同品種間的雜交利用，一方面提高了抗腹瀉種豬的利用價(jià)值，另一方面可以提高雜交后代的抗腹瀉能力，減少仔豬腹瀉死亡率，從而提高了豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。