黃桂華，葉靜，肖美添，張學(xué)勤，張娜

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門，361021)

海帶是一種常見的重要大型經(jīng)濟(jì)海藻，在我國分布廣泛，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的95%，常作為食品，又是重要的醫(yī)藥工業(yè)原料。迄今為止，已從海帶中提取多種多糖，主要包括巖藻聚糖、褐藻膠、褐藻淀粉[1]，三者主要存在于海帶細(xì)胞壁間及細(xì)胞質(zhì)中[2-3]，化學(xué)組成不同。

巖藻聚糖，又稱褐藻糖的硫酸多糖或褐藻聚糖，是海帶中所固有的細(xì)胞間水溶性雜多糖，在海帶中的含量為0.3%～1.5%。從海帶中提取的巖藻聚糖主要成分為L-巖藻糖及硫酸基，還含少量單糖，主要有甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)受海帶收獲季節(jié)、生長環(huán)境及海帶品種的影響較大[4]。巖藻聚糖是海帶中特效生理活性成分，主要有抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗肝損傷及抗病毒等生理活性[5-10]，還可開發(fā)作為乳化劑使用[11]。而分子鏈末端的硫酸基和L-巖藻糖是影響其生理活性的最重要因子。L-巖藻糖可通過抑制K562細(xì)胞增殖起到抗腫瘤作用[12]，并且其抗腫瘤活性還與糖代謝產(chǎn)物密切聯(lián)系[13]，由于巖藻聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并非單一結(jié)構(gòu)的化合物，主要是通過測定其主要成分L-巖藻糖的含量對其進(jìn)行定量分析。

目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)的巖藻聚糖含量的檢測方法，常用的定量方法有Dische比色法、高效液相色譜法、氣相色譜法、CAMERON法[14]。其中Dische法簡便、準(zhǔn)確，安全可靠且分析成本低，無需昂貴儀器。但存在顯色反應(yīng)時間過長，分析速度較慢的缺點。本文對Dische比色法進(jìn)行改進(jìn)，并用于測定不同地區(qū)不同收獲季節(jié)的12種海帶中巖藻聚糖含量。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

海帶，產(chǎn)自福建霞浦、泉港、連江和山東榮成等地區(qū)；L-半胱氨酸鹽酸鹽，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-巖藻糖，上海麥克林生化科技有限公司；巖藻聚糖樣品，青島明月海藻集團(tuán)有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、濃H2SO4均為分析純。

UV-1800紫外可見分光光度計，上海美普達(dá)儀器有限公司；DK-S11型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；BSA124S電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器，北京博醫(yī)實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Dische比色法測定L-巖藻糖的含量

Dische法測定L-巖藻糖含量的實驗原理見文獻(xiàn)[15]其操作步驟為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制0.1 mg/mL的L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)液，并逐級稀釋成質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于4 ℃冰箱中備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別移取1 mL上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白液于25 mL的具塞玻璃試管，冰水浴中加入4.5 mL體積分?jǐn)?shù)87%的H2SO4溶液，搖勻于冰浴中放置1 min，置于室溫下幾分鐘后，使溶液回升至室溫，在沸水浴中加熱10 min，室溫中加入3%的L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液0.1 mL，室溫下靜置4 h，分別測定396 nm和427 nm的吸光度A396及A427，以A396-A427為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

考察振蕩，溫度，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量對顯色反應(yīng)的影響，確定最佳條件。

1.2.2 不同地區(qū)12種海帶巖藻聚糖含量的測定

原料預(yù)處理：將來自不同海域的干海帶清洗干凈后粉碎，過200目的篩網(wǎng)，分別稱取30 g，在240 mL 95%乙醇下回流3 h，進(jìn)行脫色脫脂及除去海帶中的甘露醇。過濾，將回流得到的海帶粉于40 ℃恒溫烘干。

巖藻聚糖提取工藝：取預(yù)處理過的干燥海帶粉5 g于250 mL的燒杯中，加入200 mL的蒸餾水，在70℃下恒溫浸提5 h，過濾。加入0.25倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%CaCl2溶液以除去濾液中的褐藻膠，靜置、過濾，將濾液減壓濃縮至一定體積，加入95%的乙醇至體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液，使巖藻聚糖沉淀，離心收集沉淀，冷凍干燥至恒量，即為巖藻聚糖粗品。

褐藻糖膠含量測定：采用改進(jìn)的Dische比色法測定海帶中L-巖藻糖，分別配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL的來自不同地區(qū)海帶中提取得到的巖藻聚糖樣品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法測其吸光度。計算來自不同地區(qū)海帶中L-巖藻糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 改進(jìn)的Dische比色法的建立

2.1.1 振蕩對顯色穩(wěn)定性的影響

振蕩條件對顯色穩(wěn)定性的影響如圖1所示。

圖1 振蕩條件對顯色穩(wěn)定性的影響Fig.1 Shaking conditions effect on the color stability

如圖1所示，分別考察了在振蕩及靜置條件下吸光度隨時間的變化，巖藻聚糖質(zhì)量濃度為60 μg/mL時，振蕩條件下，在3 h時吸光度基本不變，顯色達(dá)到穩(wěn)定，靜置條件下，顯色穩(wěn)定需要4 h。由于振蕩條件加速液體流動，因此加速了L-半胱氨酸鹽酸鹽與L-巖藻糖的反應(yīng)，使其在較短的時間內(nèi)反應(yīng)完全，達(dá)到顯色穩(wěn)定。低濃度下反應(yīng)完全的時間比高濃度下短，顯色更快速達(dá)到穩(wěn)定。

2.1.2 溫度對顯色穩(wěn)定性的影響

分別考察巖藻聚糖質(zhì)量濃度為30、80 μg/mL溫度對顯色穩(wěn)定性的影響，見圖2。在室溫下靜置，顯色穩(wěn)定需要4 h，在40 ℃下靜置時，顯色在1 h時基本達(dá)到穩(wěn)定，升高溫度可縮短反應(yīng)穩(wěn)定的時間，由于加熱促進(jìn)L-巖藻糖與半胱氨酸鹽酸鹽的反應(yīng)。繼續(xù)升高溫度，當(dāng)溫度為60 ℃時，吸光度值隨時間的變化下降，可能是溫度過高，破壞L-半胱氨酸鹽酸鹽與L-巖藻糖反應(yīng)得到的產(chǎn)物，導(dǎo)致顏色褪色，從而吸光度值減小。因此反應(yīng)選擇最適宜的溫度為40 ℃。

圖2 溫度對顯色穩(wěn)定性的影響Fig.2 Temperature effect on the color stability

2.1.3L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量對顯色穩(wěn)定性的影響

圖3為L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量對顯色穩(wěn)定時間的影響。分別加入0.1、0.2、0.3 mL的L-半胱氨酸鹽酸鹽于1 mL濃度為80 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)L-巖藻糖溶液中，1、2、3、4、5 h時測定其吸光度，考察顯色的穩(wěn)定性。采用傳統(tǒng)的Dische比色法，添加0.1 mL的L-半胱氨酸鹽酸鹽，顯色穩(wěn)定時間為4 h。增加L-半胱氨酸鹽添加量，大大縮短了顯色反應(yīng)時間，由于反應(yīng)物L(fēng)-半胱氨酸鹽酸鹽的增加，加快其與L-巖藻糖的顯色反應(yīng)，縮短了顯色穩(wěn)定時間。

圖3 L-半胱氨酸鹽添加量對顯色穩(wěn)定性的影響Fig.3 L- cysteine hydrochloride effect on the color stability

2.1.4 方法的確定

圖4和圖5分別為改進(jìn)的Dische法及Dische比色法對顯色反應(yīng)時間的影響。圖4為改進(jìn)的Dische法，在振蕩條件下，溫度40 ℃，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量0.2 mL的條件下，顯色反應(yīng)約40 min達(dá)到穩(wěn)定，由圖5可知，采用傳統(tǒng)Dische法進(jìn)行操作，其顯色穩(wěn)定時間需要4 h。由結(jié)果可知，改進(jìn)的Dische比色法對L-巖藻糖進(jìn)行測定，大大縮短了顯色穩(wěn)定時間，提高測定方法的效率。

圖4 改進(jìn)的Dische法吸光度隨時間的變化Fig.4 Variation of absorbance with time using the modified Dische colorimetric method

圖5 Dische法吸光度隨時間的變化Fig.5 Variation of absorbance with time in Dische colorimetric method

2.1.5L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

采用改進(jìn)Dische法操作的方法，冷卻至室溫后加入3%的半胱氨酸鹽酸鹽溶液0.2 mL，混勻后，置于40 ℃，160 r/min的恒溫振蕩器中振蕩，40 min后測其吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如下。

圖6 L-巖藻聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.6 L-fucose standard work curve

由圖6中所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中可知：吸光度A與L-巖藻糖溶液濃度C的關(guān)系式：A= 0.015 99C-0.027 82，其相關(guān)系數(shù)R2= 0.998，結(jié)果說明在一定的范圍內(nèi)L-巖藻糖質(zhì)量濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 方法學(xué)的考察

2.2.1 重復(fù)性考察

準(zhǔn)確吸取6份質(zhì)量濃度為80 μg/mL的樣品溶液1 mL各置于25 mL的具塞試管中，按改進(jìn)的Dische比色法測定吸光度。實驗結(jié)果見表1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96%，表明改進(jìn)Dische法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 2 Results of reproducibility experiment

2.2.2 中間精密度考察

準(zhǔn)確吸取6份質(zhì)量濃度為80 μg/mL的樣品溶液1 mL各置于25 mL的具塞試管中，分別由2個分析人員使用不同的儀器及試劑，按改進(jìn)的Dische比色法測定吸光度。實驗結(jié)果見表2，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.68%，表明改進(jìn)Dische法精密度良好。

2.2.3 顯色穩(wěn)定性考察

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL的具塞試管中，按改進(jìn)的Dische比色法的操作步驟，當(dāng)顯色穩(wěn)定后，每隔30 min記錄1次吸光度值，考察顯色的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3，在5 h內(nèi)，樣品溶液吸光度值變化不大，RSD為0.64%，顯色體系在5 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Results of precision experiment

表3 顯色穩(wěn)定性考察實驗結(jié)果Table 3 Experimental results of color stability

2.2.3 加標(biāo)回收率考察

準(zhǔn)確配置80 μg/mL的樣品溶液，精確量取1 mL于25 mL的具塞試管中，分別加入50、60、70、80 μg的標(biāo)準(zhǔn)品，按改進(jìn)的Dische法測定其吸光度，計算L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品的回收率。結(jié)果表明，海帶巖藻聚糖的回收率在97.16%～105.13%，符合相關(guān)規(guī)定。

表4 加標(biāo)回收率的測定結(jié)果Table 4 Results of spiked standard recoveries

2.3 不同海域海帶巖藻聚糖的含量測定

表5 不同海域海帶巖藻聚糖含量的測定Table 5 The contents of fucoidan in different Laminaria japonica

巖藻聚糖的生理特性與L-巖藻糖含量、硫酸根含量及位置、分子質(zhì)量等因素密切相關(guān)[14]。由于巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)受多種因素如物種、生長年限、生長地點的不同而差異較大，由表4可知深海海帶中巖藻聚糖含量比近海高，養(yǎng)殖周期在后期的海帶中巖藻聚糖含量高于前期海帶。三者比較，福建霞浦的含量最高。

3 結(jié)論

(1)采用改進(jìn)的Dische比色法測定巖藻聚糖，在振蕩條件，溫度40 ℃，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為0.2 mL時，大大縮短了分析時間，其精密度高，顯色穩(wěn)定，加樣回收率高，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性相關(guān)度高，R2=0.998，為后續(xù)試驗的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ)。

(2)不同地區(qū)不同海域或生長周期不同的海帶，巖藻聚糖含量不同。其中來自深海、養(yǎng)殖周期在中后期的海帶巖藻聚糖含量較高。霞浦深海，養(yǎng)殖周期在中期的海帶中巖藻聚糖含量最高，達(dá)到1.05%。