張麗麗，萬 星，王 娟，薛競(jìng)帆，武怡瓊，靳 爽

(1．信陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院/大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院,河南 信陽(yáng)464000；2.廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510631)

0 引言

斜紋夜蛾(Spodopteralitura)屬鱗翅目(Lepidoptera)雜食性的農(nóng)業(yè)害蟲.蛻皮和變態(tài)主要由20-羥基蛻皮酮(20-Hydroxyecdysone，20E)和半萜類保幼激素 (Juvenile hormone, JH) 協(xié)調(diào)控制[1].

膽固醇是合成蛻皮激素的前體，同時(shí)也是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分.由于昆蟲體內(nèi)缺少?gòu)念^合成膽固醇必須的兩種酶：鯊烯合酶和羊毛甾醇合酶[2,3]，昆蟲只能從宿主植物中吸收膽固醇來維持其生長(zhǎng)和發(fā)育[3-5].疏水性膽固醇分子需要借助固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sterol carrier protein)完成細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而合成細(xì)胞膜和蛻皮激素[6].

SCP蛋白家族至少包括4個(gè)成員：SCP-x、SCP-2、17-β-羥基固醇脫氫酶Ⅳ和UNC-24, 每個(gè)成員蛋白都有一個(gè)共同的C端SCP-2結(jié)構(gòu)域[7].對(duì)斜紋夜蛾的SlSCP-x研究發(fā)現(xiàn)，SlSCP-x與脊椎動(dòng)物SCP-x相似，通過翻譯后部分剪切產(chǎn)生13 kDa的SlSCP-2[8].超表達(dá)SlSCP-x蛋白的細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收量增加；干擾SlSCP-x的mRNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致斜紋夜蛾幼蟲血淋巴中的膽固醇水平明顯下降，生長(zhǎng)緩慢，蛻皮延遲[8].因此，固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要.本研究以對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用的固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為靶點(diǎn)，構(gòu)建高效表達(dá)斜紋夜蛾固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞株，為篩選抑制昆蟲生長(zhǎng)抑制劑的細(xì)胞篩選系統(tǒng)奠定基礎(chǔ).

本研究采用的是酵母FRT/Flp重組系統(tǒng)Flp-InTM將攜帶目的基因SlSCP-2的表達(dá)載體pcDNA5/FRT轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO細(xì)胞株中，表達(dá)出目的蛋白用于研究該蛋白對(duì)膽固醇的吸收,為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)、pcDNA5/FRT載體和pOG44載體，香港中文大學(xué)葛偉教授饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α (E.coliDH5α)，本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株；PCR常用試劑(dNTPs，10×buffer和rTaq)、DNA限制性內(nèi)切酶、pMD18T載體、Solution Ⅰ、T4 DNA ligase、10×T4 DNA ligase buffer、Premixed protein marker(low)，TAKARA公司(大連，中國(guó))；Western blotting雜交膜，英國(guó)Whatman公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，北京天根生物科技有限公司.細(xì)胞轉(zhuǎn)染的LipofectamineTM2000，血清，F(xiàn)-12培養(yǎng)基粉末，Opti-MEM和hygromycin B，Invitrogen公司.擴(kuò)增和檢查基因表達(dá)所用的SlSCP-2上游引物5’-GGTACCATGGCCATGTACCGCAAAGGATTCGC-3’(劃線處為Kpn I酶切位點(diǎn))下游引物：5’-GCGGCCGCTTACAGTTTGGAGCGGATTGTGTCG-3’(劃線處為Not I酶切位點(diǎn)).以GFP(Green fluorescence protein)序列的ORF設(shè)計(jì)上游引物：5’-GGTACCATGGTGAGCAAGGG-3’(劃線處為Kpn I酶切位點(diǎn))，下游引物：5’-GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGCT-C-3’(劃線處為Not I酶切位點(diǎn)),由上海英駿生物工程公司合成.分別以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的SlSCP-x質(zhì)粒和EGFP-N1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

1.2 SlSCP-2 和GFP表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

運(yùn)用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Not I對(duì)pMD-18T載體進(jìn)行切割膠回收，分別將擴(kuò)增出來的目的片段SlSCP-2和GFP連入切割之后的pMD-18T中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliDH5α，經(jīng)過氨芐青霉素篩選出單克隆，運(yùn)用PCR和雙酶切鑒定.再將目的片段分別插入經(jīng)過酶切膠回收的表達(dá)載體pcDNA5/FRT中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliDH5α，經(jīng)過氨芐青霉素篩選出單克隆，運(yùn)用PCR和雙酶切初步鑒定，然后送到華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定，最后運(yùn)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行western blotting鑒定，最后命名為pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP.

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL F-12完全培養(yǎng)基．在37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染.2 μg pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pOG44載體(9∶1)，15 μL脂質(zhì)體用Opti-MEM定容至100 μL，在培養(yǎng)箱中孵育30 min后加入細(xì)胞中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).24h后收集對(duì)照組和處理組細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，并提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行western blotting鑒定.

1.4 SlSCP-2蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)膽固醇的吸收

為研究pcDNA5/FRT-SlSCP-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收，將轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞對(duì)照組熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞一份收集細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blotting鑒定SlSCP-2表達(dá)量；另外一組在細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別加入0、5、10 μmol/L FITC-Cholesterol，8 h后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞分析細(xì)胞中FITC-Cholesterol的吸收情況，重復(fù)3組.

1.5 潮霉素B篩選濃度確定

在轉(zhuǎn)染前對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行劑量反應(yīng)分析，以確定潮霉素B的最適濃度.細(xì)胞對(duì)潮霉素B敏感性的測(cè)定分別用0，50，100，250，500，750和1000 mg/L 7個(gè)不同濃度梯度的Hygromycin B處理相同數(shù)目但密度小于25%的CHO細(xì)胞，重復(fù)3組，每隔24 h觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，直到120 h(約第5天)，收集細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法統(tǒng)計(jì)3組細(xì)胞的死亡率，以殺死所有細(xì)胞的潮霉素B最低濃度(500 mg/L)為篩選濃度.

2 結(jié)果

2.1 pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將擴(kuò)增的SlSCP-2連接進(jìn)pMD18T構(gòu)成pMD18T-SlSCP-2克隆質(zhì)粒.將質(zhì)粒pcDNA5/FRT和pMD18T-SlSCP-2克隆質(zhì)粒分別用Kpn I和Not I雙酶切并純化后，經(jīng)T4 DNA Ligase連接構(gòu)成pcDNA5/FRT-SlSCP-2表達(dá)載體，由于載體pcDNA5/FRT表達(dá)的外源蛋白為非融合蛋白，沒有任何檢測(cè)標(biāo)記，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的直接觀察，故在載體pcDNA5/FRT的酶切位點(diǎn)Kpn I和Not I之間重新插入GFP序列的ORF，構(gòu)成另一個(gè)新的表達(dá)載體pcDNA5/FRT-GFP，作為陽(yáng)性對(duì)照，以便于檢查整個(gè)構(gòu)建過程.分別用構(gòu)建好的表達(dá)載體pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP轉(zhuǎn)化E.coliDH-5菌株，經(jīng)氨芐青霉素的篩選，得到單克隆細(xì)胞.對(duì)單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖1A)、雙酶切檢測(cè)(圖1B)和測(cè)序比對(duì)(圖1C),分析表明目的片段SlSCP-2(458 bp)和GFP(734 bp)的ORF已正確地插入到表達(dá)載體pcDNA5/FRT中.

2.2 斜紋夜蛾SlSCP-2真核表達(dá)載體的鑒定

為了檢測(cè)構(gòu)建的表達(dá)載體pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP能否正確表達(dá)目的蛋白，將構(gòu)建的表達(dá)載體pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入Flp-InTM定點(diǎn)整合的中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢細(xì)胞CHO中，轉(zhuǎn)化24 h后，通過熒光倒置顯微鏡觀察，GFP成功表達(dá)，見圖2A，收集細(xì)胞總蛋白，用Anti-SlSCP-2抗體做western blotting檢測(cè)，見圖2B，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞成功表達(dá)出大小約13 kDa的SlSCP-2蛋白，小于16 kDa，可能是因?yàn)椴迦氡磉_(dá)載體pcDNA5/FRT中的SlSCP-2序列在CHO細(xì)胞內(nèi)翻譯出16 kDa的 pro-SlSCP-2蛋白被蛋白酶切去N端約20個(gè)氨基酸肽段形成了SlSCP-2[9，10].此外，在western blotting檢測(cè)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的細(xì)胞株均在15～25 kDa、35～40 kDa和100～130 kDa之間檢測(cè)出未知蛋白的表達(dá)，可能由于用于實(shí)驗(yàn)的抗體為多克隆抗體，能夠與CHO細(xì)胞中存在的某些未知蛋白結(jié)合.

圖1 PCR (A)、雙酶切 (B)和目的片段測(cè)序 (C)檢測(cè)SlSCP-2(458 bp)和GFP(734 bp)的ORF在表達(dá)載體pcDNA5/FRT上插入情況Fig. 1 Detection of the ORF of SlSCP-2(458 bp)andGFP(734 bp)inserted into pcDNA5/FRT expression vectorby PCR (A), double digestion (B) and sequencing (C)

2.3 真核細(xì)胞中SlSCP-2蛋白表達(dá)對(duì)膽固醇吸收的影響

為了進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染SlSCP-2蛋白的細(xì)胞株對(duì)膽固醇吸收的影響，首先通過western blotting檢測(cè)經(jīng)pcDNA5/FRT-SlSCP-2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h的CHO細(xì)胞是否表達(dá)了SlSCP-2目的蛋白, 結(jié)果表明，用Anti-SlSCP-2蛋白抗體能檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞中SlSCP-2的蛋白表達(dá)(圖3A).

細(xì)胞先培養(yǎng)在無膽固醇的培養(yǎng)基中，然后再轉(zhuǎn)移到含不同濃度膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，然后用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)FITC-膽固醇含量的變化.流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，經(jīng)pcDNA5/FRT-SlSCP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Spli221細(xì)胞中膽固醇含量隨著膽固醇濃度的增加而提高(圖 3B).以上結(jié)果說明, SlSCP-2蛋白促進(jìn)了細(xì)胞從培養(yǎng)基中對(duì)膽固醇的吸收.

圖2 SlSCP-2和GFP在CHO中瞬時(shí)表達(dá)(A)和western blotting分析(B)

注：A. 熒光倒置顯微鏡觀察GFP蛋白表達(dá); B. western blotting檢測(cè)SlSCP-2蛋白表達(dá); CK: 原核誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白SlSCP-2; CHO: 未做轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞總蛋白; pcDNA5/FRT：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA5/FRT的CHO細(xì)胞總蛋白；pcDNA5/FRT-GFP: 質(zhì)粒pcDNA5/FRT-GFP轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞總蛋白; pcDNA5/FRT-SlSCP-2：質(zhì)粒pcDNA5/FRT-SlSCP-2轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞總蛋白.

圖3 SlSCP-2蛋白在CHO細(xì)胞中在細(xì)胞中的表達(dá)(A)對(duì)膽固醇吸收(B)的影響Fig. 3 The effect of the expression of SlSCP-2 protein in CHO cells (A) on the absorption of cholesterol (B)

注：A. western blotting檢測(cè)SlSCP-2蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá); B. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SlSCP-2蛋白在含膽固醇培養(yǎng)基中8 h后細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的變化.

2.4 細(xì)胞對(duì)潮霉素B敏感性的測(cè)定

為了篩選出目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株，采用潮霉素B淘汰未發(fā)生轉(zhuǎn)化的不具有潮霉素B抗性的細(xì)胞株.當(dāng)潮霉素B進(jìn)入無抗性的細(xì)胞中，在細(xì)胞中巰基化合物的作用下獲得電子而被激活，通過誘導(dǎo) mRNA 模板的誤讀而抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致無抗性細(xì)胞的死亡，而那些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株因具有潮霉素B抗性而得以存活[9].潮霉素B的濃度過高也會(huì)把陽(yáng)性單克隆細(xì)胞殺死，不利于篩選；潮霉素B的濃度過低則大量非陽(yáng)性單克隆細(xì)胞存活，假陽(yáng)性增多，篩選效率降低[9].因此，確定最適的潮霉素B的濃度對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選工作至關(guān)重要.

為了確定用于篩選的最適潮霉素B的濃度，分別用0、50、100、250、500、750和1000 mg/L等7個(gè)不同濃度梯度的潮霉素B處理相同數(shù)目但密度小于25%的CHO細(xì)胞，重復(fù)3組，每隔12 h觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，直到120 h(約第5天)，收集細(xì)胞，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法(Flp-InTMsystem from invitrogen)統(tǒng)計(jì)3組細(xì)胞的死亡率.由觀察結(jié)果可知，隨著潮霉素B濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞死亡率提高.最適作用濃度應(yīng)為在1～2周內(nèi)能夠殺死全部非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的最低藥物濃度.結(jié)果表明，在相同的作用時(shí)間里，500 mg/L的潮霉素B能將非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死，見表1.

表1 臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定不同濃度的潮霉素B處理下CHO細(xì)胞的死亡率 (%)

這些結(jié)果為進(jìn)一步篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的pcDNA5/FRT-SlSCP-2細(xì)胞株提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

3 討論

固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是生物體內(nèi)廣泛存在的蛋白，主要參與固醇類和脂類的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn).在脊椎動(dòng)物中，主要在蛋白的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位、表達(dá)模式、調(diào)控模式、功能及應(yīng)用等方面進(jìn)行了深入研究.而在昆蟲中該蛋白的研究相對(duì)較少，目前已經(jīng)在果蠅、埃及伊蚊、岡比亞按蚊、棉鈴蟲、棉貪夜蛾、斜紋夜蛾和家蠶中發(fā)現(xiàn)了固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[8,12，13].研究主要集中在該蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)模式、調(diào)控模式、組織和亞細(xì)胞定位，但是對(duì)于該蛋白的應(yīng)用方面研究較少.應(yīng)用埃及伊蚊的固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AeSCP-2作為靶點(diǎn)，已篩選出AeSCP-2的抑制劑AeSCPI, 能夠抑制AeSCP-2與膽固醇的結(jié)合，阻斷蛻皮激素的生物合成，從而有效地殺死埃及伊蚊[14].后續(xù)的研究還發(fā)現(xiàn)該抑制劑對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲也具有良好的殺蟲效果[15].

斜紋夜蛾Spli221細(xì)胞中超表達(dá)該蛋白能夠增加細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收；而抑制該蛋白的表達(dá)，則血淋巴中膽固醇的含量下降，蟲體蛻皮延遲，生長(zhǎng)緩慢[8].利用該蛋白優(yōu)化的三維結(jié)構(gòu)通過虛擬篩選、體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和生物鑒定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了4種抑制劑與蛋白有高的親和力[6].這些結(jié)果說明，SlSCP-2對(duì)斜紋夜蛾的正常生長(zhǎng)和發(fā)育是非常重要的，應(yīng)用此蛋白進(jìn)行昆蟲生長(zhǎng)抑制劑的篩選是可行的.但是原核表達(dá)體系存在表達(dá)蛋白修飾和高級(jí)折疊結(jié)構(gòu)不完整的特點(diǎn)，可能影響該蛋白的功能[16-17].細(xì)胞具有能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)結(jié)構(gòu)完整目的蛋白的優(yōu)點(diǎn)，目前在果蠅屬、蚊和家蠶等昆蟲中建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞株用于蛋白功能的研究和化合物的高通量篩選[18-20].在家蠶中，已經(jīng)構(gòu)建了家蠶30Kc6蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞株，運(yùn)用此轉(zhuǎn)化細(xì)胞株可以顯著提高重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，EPO)在該細(xì)胞株中的表達(dá)，表達(dá)量增加達(dá)5到10倍[21].并且運(yùn)用此轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株研究還發(fā)現(xiàn)家蠶30Kc6蛋白抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制[20].在化合物高通量篩選方面的研究，已經(jīng)成功構(gòu)建了銅綠蠅Luciliacuprina乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞株(Human Embryonic Kidney 293 cells，HEK293)，并應(yīng)用該蛋白作為藥物靶點(diǎn)，通過高通量篩選鑒定新的乙酰膽堿酯酶抑制劑[18].

4 結(jié)論

本研究在細(xì)胞水平瞬時(shí)高效表達(dá)SlSCP-2蛋白，顯著提高了細(xì)胞中膽固醇的吸收，利用SlSCP-2為靶標(biāo)蛋白進(jìn)行昆蟲生長(zhǎng)抑制劑的篩選是可行的.潮霉素篩選濃度的確定為進(jìn)一步獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株提供了實(shí)驗(yàn)參考.這些都為建立斜紋夜蛾固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞株用于化合物的篩選和蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ).