呂艷陽，張文生，袁廣勝，陳越超，葉盈珊

(1.信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000；2.中山紀(jì)念中學(xué)，廣東 中山528454)

0 引言

隨著稀土在農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的不斷擴大，稀土離子與生物大分子的相互作用及對生物大分子結(jié)構(gòu)和功能方面的影響日益受到重視.蛋白質(zhì)是一種含多個配位基團的生物大分子，其生物功能與其特定結(jié)構(gòu)密切相關(guān).稀土進入人體內(nèi)與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，會影響甚至改變蛋白質(zhì)分子固有的結(jié)構(gòu)和功能.因此研究稀土與蛋白質(zhì)的相互作用對于了解稀土離子在體內(nèi)的代謝過程及生物效應(yīng)的作用機理有實際而深遠的意義[1].

牛血清白蛋白與內(nèi)源性化合物、藥物分子及許多金屬離子如Cu2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Co2+和Cr2+等的相互作用已進行了較為廣泛的研究[2-5].但與稀土金屬離子作用的研究較少.本文用熒光光譜法研究了稀土金屬Sm3+離子與BSA的相互作用，為進一步探究稀土離子在生物無機化學(xué)、藥化學(xué)等領(lǐng)域的研究提供一些理論和應(yīng)用價值方面的信息.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Cary Eclipse熒光分光光度計，美國瓦里安公司；HH-2恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；精密pH計，上海雷磁有限公司；電子分析天平，上海菁海儀器有限公司.

試劑：BSA溶液，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三氧化二釤(Sm2O3)，分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所；Tris(三羥甲基氨基甲烷)固體粉末，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸溶液(6 mol/L)，北京中諾泰安科技有限公司.

1.2 溶液的配制

配制8×10-6mol/L的BSA：用分析天平準(zhǔn)確稱量0.052 g BSA固體粉末，加蒸餾水使之完全溶解，然后定容至100 mL容量瓶中.

配制不同pH值(6.5、7.5、8.5)Tris-HCl緩沖溶液:先配制0.1 mol/L Tris溶液，即用分析天平準(zhǔn)確稱量3.029 g Tris(三羥基甲基甲烷)固體粉末，加蒸餾水使之完全溶解，然后移至250 mL容量瓶中(Tris稱兩份，溶解至兩個250 mL容量瓶).取配制好的0.1 mol/L的Tris溶液，使其體積為V≥120 mL(夠用就好，120 mL左右，取三份).然后用精密pH計(帶磁力攪拌器)向其中加6 mol/L的鹽酸溶液分別配制pH值為6.5、7.5、8.5的Tris-HCl緩沖溶液.

配制0.1 mmol/L的Sm3+標(biāo)準(zhǔn)溶液：用分析天平準(zhǔn)確稱量1.25 mg三氧化二釤固體粉末，用6 mol/L的鹽酸溶液在HH-2恒溫水浴鍋條件下溶解，然后定容轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中.

1.3 實驗方法

取8支10 mL刻度比色管，加入2.0 mL 8×10-6mol/L的BSA溶液和不同體積的Sm3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，分三組，分別用pH值為6.5、7.5、8.5 Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處，固定激發(fā)波長為280 nm，記錄282～500 nm范圍的熒光發(fā)射光譜.實驗室激發(fā)狹縫10 nm而發(fā)射狹縫為5 nm，測定熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Sm3+離子濃度對BSA熒光光譜的影響

按1.3實驗方法設(shè)1號比色管為空白對照組(2 mL BSA，8 mL Tris-HCl)，2～8號比色管先加入2 mL BSA，然后分別加入50、100、150、200、250、300、350 μL的1×10-4mol/L Sm3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用pH值6.5的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處.掃描Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜圖，結(jié)果見圖1.

同上，改變Sm3+標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍，再用pH值7.5的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處.掃描Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜圖，結(jié)果見圖2.

同上，改變Sm3+標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍，再用pH值8.5的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL刻度線處.掃描Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜圖，結(jié)果見圖3.

圖1 緩沖溶液pH值為6.5時Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig. 1 Fluorescence emission spectra ofSm3+ and BSA(pH=6.5)圖中從a到f曲線：往BSA中加入的Sm3+離子濃度依次為0、0.5×10-5、1.0×10-5、1.5×10-5、2.0×10-5、2.5×10-5、3.0×10-5、3.5×10-5 mol/L

圖2 緩沖溶液pH值為7.5時Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig. 2 Fluorescence emission spectra ofSm3+ and BSA(pH=7.5)圖中從a到f曲線：往BSA中加入的Sm3+離子濃度同圖1

圖3 緩沖溶液pH值為8.5時Sm3+與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig. 3 Fluorescence emission spectra ofSm3+ and BSA(pH=8.5)圖中從a到f曲線：往BSA中加入的Sm3+離子濃度同圖1

由圖1、圖2、圖3可以看出，在選定的Sm3+濃度范圍內(nèi)，Sm3+對BSA的熒光均產(chǎn)生了猝滅，且其熒光強度隨著Sm3+濃度的增加而降低.

2.2 稀土Sm3+離子與BSA的相互作用的探究

往BSA中加入稀土Sm3+會產(chǎn)生熒光強度降低的現(xiàn)象，這是因為熒光物質(zhì)與其他溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用而產(chǎn)生猝滅.故稀土Sm3+離子與BSA的相互作用使熒光強度降低也屬于熒光猝滅.發(fā)生熒光猝滅的原因很多，主要有靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅.動態(tài)猝滅也稱為碰撞猝滅[4].處于單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生反應(yīng)后，生成沒有熒光的基態(tài)復(fù)合物.而靜態(tài)猝滅則是指部分熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子相互作用生成非熒光的絡(luò)合物，故而靜態(tài)猝滅也稱為組合化合物的猝滅.

牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光是由分子中色氨酸殘基和絡(luò)氨酸殘基引起的，稀土Sm3+離子的加入能使其熒光規(guī)律性猝滅.熒光猝滅過程有動態(tài)和靜態(tài)之分，動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光劑激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程，遵從Stern-Volmer方程[5]：

F0/F=1+Kqτ0C=1+KsvC,

(1)

式(1)中:F0/F指未加入猝滅劑與加入猝滅劑后的相對熒光強度.Kq是指猝滅速率常數(shù).τ0是不含有猝滅體時熒光體的熒光壽命[3](對于大多數(shù)的生物分子τ0多為10-8s).Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù).Ksv的大小表示稀土Sm3+離子與BSA間的作用強弱.

綜上所述，根據(jù)Stern-Volmer方程，在Tris-HCl緩沖溶液pH值為6.5、7.5、8.5的情況下測定熒光發(fā)射光譜在350 nm波長的相對熒光強度為F，以F0/F為縱坐標(biāo)，以添加的Sm3+溶液的濃度C為橫坐標(biāo)作圖，得出稀土Sm3+離子與BSA的Stern-Volmer猝滅曲線，如圖4所示.

圖4 不同pH值時Sm3+離子對BSA的熒光猝滅Stern-Volmer圖Fig. 4 Fluorescence emission spectra of Sm3+and BSA at different pH values

從圖1、圖2、圖3和圖4可知，隨著加入的Sm3+離子的濃度的增大，整個體系的熒光發(fā)射峰逐漸降低，此時Sm3+離子與BSA可能在基態(tài)時生成了不發(fā)光的復(fù)合物，從而導(dǎo)致了熒光強度的降低，產(chǎn)生了猝滅效果.

為確認Sm3+離子對BSA熒光猝滅的機理，按照圖1、圖2、圖3中曲線在λex= 350 nm出的熒光強度及處理圖4的數(shù)據(jù)，利用式(1)對各實驗結(jié)果進行處理，結(jié)果如表1所示.

表1 Sm3+離子對BSA的熒光猝滅常數(shù)Ksv和雙分子猝滅過程常數(shù)Kq

查詢資料，各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數(shù)是2.0×1010L·mol-1·s-1,本文得到的Kq遠大于這一數(shù)值.說明了Sm3+離子對BSA的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅，而是形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅[6].

2.3 稀土Sm3+離子與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合數(shù)n

在靜態(tài)猝滅中，利用何錫文等[7]推導(dǎo)的公式(2)求出結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位數(shù)n:

lg[F/(F0-F)]=-lgKa-nlg[Q],

(2)

式(2)中：F0、F同樣指的是猝滅劑與無猝滅劑時的熒光強度，Ka是BSA與稀土Sm3+離子的結(jié)合常數(shù)，[Q]是猝滅劑的平衡濃度，n是結(jié)合數(shù).由圖4和表1可以得出：pH值為7.5時擬合直線方程線性關(guān)系最好.pH 7.5時擬合的線性方程為：

lg[F/(F0-F)]= -5.945 -1.22 lg[Q],

R= 0.997.

則Ka= 9.652×105L·mol-1,結(jié)合數(shù)n= 1.22.

2.4 稀土La3+和Ce3+離子與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合數(shù)n

本文也研究了另外兩種稀土離子La3+和Ce3+與BSA相互作用的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)它們對BSA的熒光同樣產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅，只是強度稍弱，pH值為7.5時結(jié)合常數(shù)Ka= 9.3×104L·mol-1、結(jié)合數(shù)n= 1.15.

3 結(jié)論

本文通過對稀土Sm3+離子與BSA相互作用的熒光光譜的研究，可以發(fā)現(xiàn)Sm3+離子對BSA有良好的熒光猝滅作用，并且猝滅過程為靜態(tài)猝滅.通過比較可知，Tris-HCl緩沖溶液pH值為7.5時，向濃度為8×10-6mol/L的BSA溶液加入不同濃度的Sm3+離子時，其猝滅過程速率常數(shù)Kq= 4.12×1012L·mol-1·s-1、結(jié)合常數(shù)Ka= 9.652×105L·mol-1和結(jié)合數(shù)n= 1.22.該結(jié)果為進一步探究稀土離子在生物無機化學(xué)、藥化學(xué)等領(lǐng)域的研究具有應(yīng)用價值.