王潔瓊，趙玉杰，周薇帆，周云飛，陳田田，劉建勛，李新生

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是一種可以誘發(fā)雛雞產(chǎn)生急性、高度接觸性和免疫抑制的傳染病，該病首先在美國特拉華州甘布羅鎮(zhèn)出現(xiàn)，故又被稱為“甘布羅病”。由于死于該病的雞腎臟受損，最初被稱為“禽腎病”，但后來被正式命名為雞傳染性法氏囊病(IBD)[1-2]。

傳染性法氏囊病毒(IBDV)屬雙股RNA病毒科禽雙股RNA病毒屬，病毒顆粒為單層衣殼結(jié)構(gòu)，無囊膜，是典型的六邊形結(jié)構(gòu)，呈正二十面體。IBDV有2個(gè)血清型，其中對(duì)雞有致病性的血清Ⅰ型毒株又分為經(jīng)典毒株(classical IBDV，cIBDV)、減毒株(attenuated IBDV)、變異毒株(variation IBDV，vIBDV)和超強(qiáng)毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)[3]。IBDV超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為“影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重要疾病”[4]。有研究表明，IBDV的VP2蛋白是主要的宿主保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異以及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[5-6]。VP2蛋白的氨基酸變異對(duì)病毒侵染宿主靶細(xì)胞的過程至關(guān)重要，是影響IBDV細(xì)胞嗜性和毒力差異的主要因素。因此，對(duì)不同毒株的VP2進(jìn)行氨基酸序列分析，不僅有助于了解毒株之間的親緣關(guān)系，分析IBD的流行特點(diǎn)，還能為其病原抗原性和毒力的研究積累資料。本研究對(duì)從河南某地區(qū)雞群分離出的1株IBDV進(jìn)行馴化，使其適應(yīng)永生細(xì)胞DF-1，并對(duì)其VP2基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，從氨基酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹方面分析探討了毒株間基因變異的分子機(jī)制，旨在為篩選到免疫原性良好的IBD疫苗株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 毒株、SPF雞胚和細(xì)胞 IBDV毒株X1分離自河南某地區(qū)雞群的發(fā)病雞中。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司。DF-1細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)應(yīng)用10日齡SPF雞胚制備。

1.1.2 主要試劑 LATaq酶、DNA Marker 5000、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit Ver 5.0、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自天根生化科技(北京)有限公司；大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；高純度質(zhì)粒小提試劑盒，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；pGEM-T Easy Vector，購自Promega公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)合成 參照GenBank上已登錄的IBDV UK661株A片段mRNA序列(X92760)，利用Oligo 7.0軟件分析并設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 756 bp的包含VP2全長基因的片段。引物序列為：上游引物P17.5′-GAACTCCTCCTTCTACAATGCT-3′；下游引物P56.5′-TCGTGATGACCACAGGGAATAG-3′。引物由華大基因合成。

1.2 IBDV X1株雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測(cè)定

IBDV X1毒株在SPF雞胚上穩(wěn)定傳代后，將雞胚絨毛尿囊膜研磨液上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取10-5，10-6，10-7，10-8，10-95個(gè)稀釋度，經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度病毒接種5枚雞胚，接種量均為0.1 mL/枚，于37 ℃孵化器內(nèi)孵化，剔除24 h內(nèi)死亡雞胚，至144 h時(shí)記錄各組雞胚死亡情況及胚體病變情況，按文獻(xiàn)[7]中介紹的Reed-Muench法計(jì)算尿囊膜懸液中病毒的ELD50。

1.3 IBDV X1株的DF-1細(xì)胞適應(yīng)性馴化

法氏囊組織的處理參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，取按照上述方法得到的上清液，參照文獻(xiàn)[9]將IBDV X1株經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，收集48～120 h內(nèi)死亡雞胚，研磨后如上繼續(xù)傳代。取傳至第8代的IBDV雞胚毒用PBS按照1∶200體積比稀釋，接種按常規(guī)方法制備長成單層的CEF細(xì)胞，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱吸附1 h后棄去病毒液，加入維持液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，待80%細(xì)胞出現(xiàn)病變(培養(yǎng)72～96 h)時(shí)傳代，共傳10代。取傳至第10代的IBDV CEF細(xì)胞毒接種DF-1細(xì)胞，依上述方法連續(xù)傳代，每天觀察細(xì)胞病變。

1.4 IBDV X1株細(xì)胞適應(yīng)株的電鏡觀察

將細(xì)胞毒凍融3次，4 000 r/min離心20 min，取上清液10 000 r/min離心1 h，棄去沉淀，取上清液38 000 r/min超速離心1 h，棄上清液，將沉淀用少量pH 7.4的0.01 mol/L PBS懸浮，制備負(fù)染樣品。用懸浮法吸附10 min后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸染色5 min，使用Hitachi HT 7700透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。將獲得的細(xì)胞適應(yīng)株命名為C1。

1.5 IBDV RNA的提取及cDNA的合成

將X1毒株的病毒上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后，以CAM途徑接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收獲48～120 h內(nèi)死亡雞胚，觀察雞胚死亡狀況,并無菌收取絨毛尿囊膜，研磨至勻漿，反復(fù)凍融3次后5 000 r/min離心10 min，取上清液。按MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit Ver 5.0說明書提取RNA。

將收獲的C1株DF-1細(xì)胞毒的病毒液反復(fù)凍融3次，3 500 r/min離心20 min，取上清液。按MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit Ver 5.0說明書提取RNA。

用下游引物P56(濃度為25 μmol/L)將上述2種RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。具體操作為：取10 μL RNA提取物，加入1 μL下游引物P56，70 ℃水浴10 min，冰浴5 min，加入dNTP 1 μL 、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 0.5 μL、5×M-MLV Buffer 4 μL、RNasin 0.5 μL、ddH2O 3 μL，42 ℃反應(yīng)1 h，最后75 ℃ 15 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。

1.6 VP2基因的克隆

以cDNA為模板對(duì)VP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：cDNA 2 μL，LATaq酶12.5 μL，P17(25 μmol/L) 0.5 μL，P56(25 μmol/L) 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，總計(jì)34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，操作按說明書進(jìn)行。將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體16 ℃過夜連接后，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取生長狀態(tài)良好的菌落接種于含50 mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，以4 μL培養(yǎng)菌液為模板，進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.6節(jié))。將鑒定陽性的菌液用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取其質(zhì)粒，送至武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.7 序列分析

用DNA Star和MEGA 6.0軟件將測(cè)序所得結(jié)果與GenBank上登錄的17個(gè)IBDV序列(表1)進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)應(yīng)用Clustalx軟件對(duì)它們的VP2基因高變區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列與這17個(gè)IBDV參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 IBDV參考毒株及其GenBank登錄號(hào)Table 1 IBDV reference strain and its GenBank accession number

表1(續(xù)) Continued table 1

應(yīng)用DNA STAR軟件對(duì)X1株及其細(xì)胞適應(yīng)株C1的VP2高變區(qū)及七肽區(qū)推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBDV X1株的ELD50

稀釋10-5，10-6，10-7，10-8，10-9的雞胚絨毛尿囊膜研磨液的雞胚死亡率分別為100%，100%，50%，37.5%和10%，利用Reed-Muench法計(jì)算出雞胚分離物中病毒的ELD50為10-8mL-1。

2.2 IBDV X1株細(xì)胞適應(yīng)株的馴化

將IBDV X1株雞胚病毒液接種長成單層的CEF細(xì)胞傳代并觀察細(xì)胞病變，傳至第10代時(shí)細(xì)胞病變穩(wěn)定，第10代72 h時(shí)CEF細(xì)胞圓縮、脫落懸浮(圖1)。將第10代的IBDV CEF細(xì)胞毒接種DF-1細(xì)胞傳代，至第8代細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定病變，第8代72 h時(shí)細(xì)胞圓縮，折光度增強(qiáng)，逐漸脫落懸浮，有拉網(wǎng)現(xiàn)象(圖2)。結(jié)果表明，分離株(X1株)細(xì)胞適應(yīng)株馴化成功，命名為C1株。

A.單層CEF細(xì)胞；B.第10代IBDV感染72 h的CEF細(xì)胞A. Single layer of CEF cells; B. The 10th generation of IBDV infected with CEF cells for 72 h圖1 IBDV X1株對(duì)CEF細(xì)胞的適應(yīng)性馴化Fig.1 Adaptability of IBDV strain X1 to CEF cells

A.單層DF-1細(xì)胞；B.接種第8代IBDV X1株CEF細(xì)胞毒72 h后的DF-1細(xì)胞A.Single layer of DF-1 cells;B.The status of DF-1 cells after 72 hours of inoculation with the 8th generation IBDV strain X1 from CEF cells圖2 IBDV X1株CEF細(xì)胞毒對(duì)DF-1細(xì)胞的適應(yīng)性馴化Fig.2 Adaptability of IBDV X1 strain CEF cytotoxicity to DF-1 cells

2.3 IBDV C1株細(xì)胞毒負(fù)染樣品透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

經(jīng)提純濃縮的病毒液懸滴負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察，可見單個(gè)病毒粒子呈六邊形或卵圓形，無囊膜，病毒直徑50～60 nm，有實(shí)心和空心2種病毒(圖3)。

圖3 IBDV C1株病毒粒子的透射電子顯微鏡觀察(×50 000)Fig.3 Observation of IBDV strain C1 of virus particles using electron microscopic negative staining method (×50 000)

2.4 IBDV VP2基因的克隆及鑒定

基因克隆結(jié)果顯示，X1和C1株病毒均能擴(kuò)增出長度約為1 756 bp的條帶，表明2株病毒均為IBDV毒株(圖4)。菌液PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果顯示，隨機(jī)挑取的菌落中均可以擴(kuò)增出與RT-PCR反應(yīng)長度相同的條帶(圖5)。

2.5 IBDV VP2基因序列測(cè)定及分析

表2結(jié)果顯示，分離株X1與超強(qiáng)毒株GX、OKYM、HK46、UK661、D6948的同源性較高，均為99.3%；C1株與減毒株CEF94(8號(hào)毒株)同源性較高，為99.6%，與X1株同源性為96.7%。通過對(duì)IBDV分離株及細(xì)胞適應(yīng)毒株VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性進(jìn)行比較分析判斷，分離株X1為超強(qiáng)毒株，X1株的細(xì)胞適應(yīng)毒株C1與減毒株同源性較高，毒力致弱，具有選為疫苗株的潛力。

對(duì)分離株X1及其細(xì)胞適應(yīng)毒株C1的VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列與表1中引用的IBDV參考毒株氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖6)表明，X1株與中國香港超強(qiáng)毒株HK46親緣關(guān)系較近，細(xì)胞適應(yīng)毒株C1與減毒株CEF94親緣關(guān)系較近。

M.DNA Marker DL5000；1.X1株；2.C1株 M.DNA Marker DL5000;1.Strain X1;2.Strain C1 M.DNA Marker DL5000；1.X1株；2.C1株 M.DNA Marker DL5000;1.Strain X1;2.Strain C1圖4 IBDV毒株VP2基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖5 IBDV毒株VP2基因的菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 RT-PCR of the VP2 gene of IBDV strains Fig.5 Bacteria liquid PCR of the VP2 gene of IBDV strains

毒株StrainsX1C11234567891011121314151617X196.799.399.399.399.399.397.196.797.196.098.297.195.698.296.296.796.286.3C13.497.197.197.197.197.199.698.799.698.298.297.696.598.297.497.897.486.910.72.9100.0100.0100.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.720.72.90.0100.0100.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.730.72.90.00.0100.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.740.72.90.00.00.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.750.72.90.00.00.00.097.697.497.696.798.997.896.298996.997.496.986.7

表2(續(xù)) Continued table 2

注：右上三角表示同源性(%)，左下三角表示分歧度；1～17對(duì)應(yīng)的毒株同表1。

Note：Identity in upper triangle (%) while divergence in lower triangle.The strain numbers of 1-17 are the same as Table 1.

2.6 IBDV C1株和X1株的VP2高變區(qū)及七肽區(qū)推導(dǎo)氨基酸比對(duì)

在對(duì)IBDV分離株X1進(jìn)行傳代使其適應(yīng)細(xì)胞的過程中，VP2高變區(qū)及七肽區(qū)部分氨基酸發(fā)生了變異(表3)。

表3 IBDV C1和X1株的VP2高變區(qū)(206～305位氨基酸)及七肽區(qū)(326～332位氨基酸)氨基酸突變情況Table 3 Changes in amino acid of VP2 hypervariable region (amino acids 206 to 305) and septapeptides (amino acids 326 to 332) of IBDV strain C1 and strain X1

注：P.脯氨酸；V.纈氨酸；K.賴氨酸；H.組氨酸；N.天冬酰胺；T.蘇氨酸；L.亮氨酸；E.谷氨酸；R.精氨酸；A.丙氨酸；I.異亮氨酸；Q.谷氨酰胺；D.天冬氨酸；S.絲氨酸。

Note：P.Proline;V.Valine;K.Lysine;H.Histidine;N.Asparagine;T.Threonine;L.Leucine;E.Glutamic acid;R.Arginine;A.Alanine;I.Isoleucine;Q.Glutamine;D.Aspartic acid;S.Serine.

表3結(jié)果顯示，C1株與X1株VP2相比，在第206～305位VP2高變區(qū)有11個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了改變，七肽區(qū)有1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了改變。改變?nèi)缦拢?22位(A→P)、242位(I→V)、249位(Q→K)、253位(Q→H)、256位(I→V)、279位(D→N)、284位(A→T)、290位(T→L)、294位(I→L)、299位(S→N)、300位(K→E)以及七肽區(qū)的330位(S→R)。vvIBDV X1株在第222，256，294位和299位上具有A、I、I、S 4個(gè)特征性氨基酸，這與何秀苗等[10]的研究相同。2012年，侯仲杰等[11]在研究IBDV基因組A節(jié)段編碼前體多聚蛋白的遺傳蹤跡時(shí)也發(fā)現(xiàn)，超強(qiáng)毒株與減毒株的242，253，299及330位氨基酸均不同。超強(qiáng)毒株X1的DF-1細(xì)胞適應(yīng)毒株C1也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化。通常被認(rèn)為與毒力變異相關(guān)的七肽區(qū)含有6個(gè)保守氨基酸殘基，若其中1個(gè)或2個(gè)絲氨酸被取代則必將導(dǎo)致毒力下降[12]，而減毒株C1在第330位的精氨酸R取代了超強(qiáng)毒株X1在330位的絲氨酸S。

3 討 論

雞IBD主要攻擊法氏囊并感染囊泡中的B前淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞溶解減少，最終致使囊萎縮，其不僅直接導(dǎo)致感染雞的發(fā)病與死亡，還可引起免疫抑制使雞對(duì)次生細(xì)菌或病毒的感染高度敏感，對(duì)疫苗接種的免疫應(yīng)答能力下降[13]。1986年以后，由于IBDV超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，使IBD的流行出現(xiàn)了一些新的特點(diǎn)，流行的地域性、抗原性、發(fā)病率、死亡率、病理變化與經(jīng)典IBD均有差異，使得IBD的防治面臨新的挑戰(zhàn)與困難。本研究成功克隆了從河南某雞場(chǎng)分離到的IBDV X1毒株的VP2全長基因，對(duì)其與NCBI上登錄的其他IBDV毒株的VP2基因的氨基酸序列進(jìn)行比較分析，對(duì)其致病性、VP2基因進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和鑒定。結(jié)果顯示，X1毒株對(duì)10日齡SPF雞胚的ELD50為10-8mL-1，其在第222，256，294和299位上具有A、I、I、S 4個(gè)特征性氨基酸，與vvIBDV HK46VP2基因的氨基酸序列同源性高達(dá)99.3%，確定分離株X1為vvIBDV。

雞IBDV經(jīng)典毒株、變異毒株和超強(qiáng)毒株等自然野毒株均不適應(yīng)CEF等細(xì)胞的培養(yǎng)，必須在細(xì)胞或雞胚上盲傳數(shù)代，使其對(duì)雞的毒力減弱成為減毒株，病毒才可以在細(xì)胞上增殖。對(duì)于毒力不返強(qiáng)的減毒株可篩選為IBDV活疫苗株。本研究完成了一株vvIBDV毒株致弱的全過程，將分離的1株IBDV超強(qiáng)毒株X1經(jīng)雞胚傳代8代次，CEF細(xì)胞傳代10代次，DF-1細(xì)胞傳代8代次毒力獲得細(xì)胞適應(yīng)毒株C1，并對(duì)其進(jìn)行VP2全基因克隆分析。結(jié)果顯示，在七肽區(qū)減毒株C1在第330位精氨酸R取代了超強(qiáng)毒株X1在330位的絲氨酸S；第222位氨基酸均由A變成P；決定病毒毒力的位點(diǎn)第256和284位分別由I、A變?yōu)閂和T。在IBDV VP2可變區(qū)的270～290位氨基酸之間是其3個(gè)小的親水區(qū)之一，有研究推測(cè)279和284位氨基酸的變化導(dǎo)致這一區(qū)域的親水性下降并阻止α-螺旋的形成，從而影響到病毒的表面結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果暗示了VP2可變區(qū)的279和284位氨基酸殘基對(duì)IBDV的毒力變化起著比較關(guān)鍵的作用。細(xì)胞適應(yīng)毒株C1在279位由天冬酰胺N替代了超強(qiáng)毒株X1的天冬氨酸D，在284位由蘇氨酸T替代了丙氨酸A。細(xì)胞適應(yīng)毒株能夠在DF-1上穩(wěn)定增殖，而且容易大量培養(yǎng)，病毒滴度較高，預(yù)測(cè)其具備作為滅活疫苗種毒或弱毒疫苗種毒的特征，對(duì)于此毒株的免疫原性，本實(shí)驗(yàn)室將會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行深入的研究。

目前，IBD的控制很大程度上依賴于疫苗的應(yīng)用，一個(gè)理想化的疫苗應(yīng)保護(hù)雞群抵抗疾病，尤其是在發(fā)病的急性期[14]。但減毒活疫苗和滅活疫苗都有其不同的局限性。在減毒活疫苗的情況下，選擇壓力導(dǎo)致變異毒株的產(chǎn)生，導(dǎo)致保護(hù)失敗和疾病的持續(xù)爆發(fā)[15]。同時(shí)活疫苗與母源抗體也會(huì)沖突，而滅活疫苗也存在缺點(diǎn)如成本和生產(chǎn)復(fù)雜性[16]。DNA疫苗接種是預(yù)防和控制疾病的替代方法。DNA疫苗接種包括注射攜帶編碼抗原的基因的質(zhì)粒DNA，疫苗不包含完整病毒，可防止與常規(guī)疫苗相關(guān)的問題，如復(fù)發(fā)的毒力、變異毒株的出現(xiàn)等。但DNA疫苗在目前的研究中對(duì)其是否具有交叉保護(hù)尚不清晰[17]。VP2蛋白是IBDV主要的宿主免疫保護(hù)性結(jié)構(gòu)蛋白，并且是引起病毒抗原變異的決定因素[18]。因此在以后的試驗(yàn)中，將對(duì)IBDV VP2蛋白做進(jìn)一步研究與探索。

本研究對(duì)1株vvIBDV X1及其細(xì)胞適應(yīng)株C1與參考毒株的同源性進(jìn)行了比對(duì)以及進(jìn)化樹和VP2氨基酸序列分析，比較總結(jié)其差異，初步揭示了vvIBDV在適應(yīng)細(xì)胞、從超強(qiáng)毒力向弱毒力轉(zhuǎn)化過程中，VP2高變區(qū)及七肽區(qū)氨基酸序列的變化情況，為培育篩選到免疫原性好的IBD疫苗株奠定了基礎(chǔ)。