陶英杰，劉鳳娟，畢春曉，任雪冰，曲瑞紅，李科友，徐全樂

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

山黧豆(LathyrussativusL.)具有與大豆相媲美的蛋白含量，是山黧豆屬(Lathyrus)187種作物中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛種植的栽培品種[1]，其發(fā)達(dá)的根系、與根瘤菌共生等生物學(xué)特征，使得山黧豆有極強(qiáng)的耐貧瘠性和抗旱性[2]。然而，和大多數(shù)豆科作物一樣，其體內(nèi)Cys、Met等含硫氨基酸水平較低[3-4]。這與其存在內(nèi)源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)一起被認(rèn)為是山黧豆神經(jīng)性中毒的2個(gè)并行因素[5]。實(shí)際上，β-ODAP的生物合成與含硫氨基酸的生物合成密切相關(guān)[6-7]。β-ODAP生物合成的直接前體是β-異噁唑啉-5-酮-2-L-丙氨酸[β-(isoxazoline-5-on-2-yl)-L-alanine，BIA]，BIA由異噁唑啉-5-酮(isoxazolin-5-one)與O-乙酰絲氨酸(O-acetylserine，OAS)在β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,CASase)催化下生成[8]。同時(shí)，OAS還可以在半胱氨酸合成酶(cysteine synthase，CSase)催化下生成Cys，這導(dǎo)致β-ODAP的積累與Cys的合成呈負(fù)相關(guān)。因而，同屬β取代基丙氨酸合成酶家族(β-substituted alanine synthase，BSAS family)的CSase和CASase在此過程中可能扮演著重要作用[5,9]。尤其是CASase，在山黧豆β-ODAP與硫、氮代謝平衡中可能起到分子開關(guān)的作用[5]。

研究表明，山黧豆的CASase活性與其苗期BIA的迅速積累呈顯著正相關(guān)[10-11]。CASase基因表達(dá)水平也與β-ODAP積累模式相符[5,12]。根據(jù)山黧豆CASase基因的cDNA序列推測(cè)CASase蛋白氨基酸序列與大豆、擬南芥的CASase蛋白序列分別具有88%和79%的一致性，差異主要體現(xiàn)在N端的信號(hào)肽序列，且三維結(jié)構(gòu)高度相似[5,13-14]。這種結(jié)構(gòu)的保守性對(duì)于依賴于輔因子磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)的BSAS家族發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要[14]。在大豆CASase中，PLP的結(jié)合位點(diǎn)是Lys95[14]。構(gòu)建大豆CASase蛋白的K95A點(diǎn)突變體發(fā)現(xiàn)，突變體蛋白結(jié)構(gòu)中的吡啶環(huán)相對(duì)于野生型發(fā)生了15°的位移，并導(dǎo)致了CASase活性的喪失[14]。據(jù)此構(gòu)建山黧豆CASase蛋白K95A、K95E和K95R點(diǎn)突變體，發(fā)現(xiàn)CASase活性完全喪失[5]。說明山黧豆與大豆CASase功能相似，均可能在硫代謝中扮演重要作用，是山黧豆β-ODAP與硫代謝平衡中的關(guān)鍵酶。對(duì)CASase的遺傳操作是在增加含硫氨基酸含量的同時(shí)，降低β-ODAP含量的一條有效途徑[5,15-16]。因而，利用CRISPR/Cas9敲除山黧豆CASase基因?qū)⑹怯幸娴膰L試。本研究克隆了山黧豆CASase基因DNA序列全長，并據(jù)此構(gòu)建了CRISPR/Cas9敲除載體，采用葉盤轉(zhuǎn)化法敲除山黧豆CASase基因，以期為篩選“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

將山黧豆種子置于含蛭石、腐殖土、珍珠巖(三者體積比為1∶1∶1)的混合基質(zhì)中，23 ℃覆膜萌發(fā)4 d。采集黃化苗根部組織，備用。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用CTAB法[17]提取黃化苗根部組織基因組DNA。用NanoDrop 1 000 (Thermo Scientific,USA)微量核酸密度儀檢測(cè)DNA質(zhì)量，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

1.2.2CASase基因的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定 根據(jù)CASase基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào):KJ563188)設(shè)計(jì)引物：P1.5′-GGCGAATTCCTCGGAACTGTGGAAGAAAT-3′；P2.5′-CGGGATCCATCACCTTCCTCAAGCGAACCTC-3′，引物由Takara公司合成。以1.2.1提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系50 μL，包括Takara LATaq酶(5 U/μL)0.5 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+)5 μL，dNTP Miture(各2.5 mmol/L)8 μL，模板DNA 2.5 ng，上、下游引物各2 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。將該反應(yīng)混合物短暫離心至管底，于Jena EasyCycler PCR儀(耶拿，德國)上進(jìn)行反應(yīng)。降落PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s(-0.5 ℃/循環(huán))，72 ℃ 2 min 15 s，30個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠純化、切膠回收后送寶生物(大連)公司測(cè)序。

1.2.3CASase基因序列分析、sgRNA設(shè)計(jì)及體外活性檢測(cè) 利用BLAST確定上述測(cè)序結(jié)果同源性，用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用在線軟件Augustus進(jìn)行外顯子與內(nèi)含子分析；利用sgRNACas9設(shè)計(jì)sgRNA序列并進(jìn)行脫靶分析，優(yōu)選5個(gè)潛在sgRNA靶位點(diǎn)。應(yīng)用luciferase SSA重組法(single-strand annealing recombination assay)對(duì)優(yōu)選的5個(gè)sgRNA(表1)進(jìn)行體外活性初篩。用HEK293A鋪 24孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)50%左右時(shí)用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h收取細(xì)胞，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(碧云天)說明書檢測(cè)雙熒光的活性。用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性的比值(Dual-Luciferase Reporter,DLR)表示sgRNA活性，該值越大，表示活性越強(qiáng)。以不添加sgRNA和pcDNA3.1-Cas9載體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對(duì)照，以添加100 ng pSSA-CLTA1、0.5 μg sgRNA-CLTA1的轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陽性對(duì)照。

1.2.4 CRISPR/Cas9基因敲除載體的構(gòu)建 選取活性較高的4個(gè)sgRNA靶位點(diǎn)分別各自設(shè)計(jì)1對(duì)20 bp左右的Oligo DNA，包含BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)(表1)。使用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切pPLatU6-sgRNA載體，將上述Oligo DNA退火后連接到pPLatU6-sgRNA(Biomics Custom)質(zhì)粒中。

表1 本研究設(shè)計(jì)的sgRNA Oligo DNA序列Table 1 Designed Oligo DNA sequences of sgRNA in the study

注：sgRNA模板序列中下劃線為PAM序列；Oligo DNA中5′和3′端下劃線為接頭序列，其中包含BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。

Note：The underline in sequence of sgRNA template is PAM,the nuderline of Oligo DNA are adapters,includingBamHⅠ andXbaⅠ sites.

采用同尾酶法，將重組的pPLatU6-sgRNA載體進(jìn)行NheⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收小片段，將其與經(jīng)XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切的pPLHACas9載體進(jìn)行T4 DNA酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，22 ℃培養(yǎng)1 h后，涂Kan+平板篩選，得到的重組載體pPLHACas9，即為構(gòu)建好的CRISPR/Cas9植物基因敲除載體。

1.2.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將驗(yàn)證陽性的重組載體pPLHACas9，采用CaCl2凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。隨機(jī)挑選陽性克隆，采用引物AtU6-Fwd和M13fwd進(jìn)行菌落PCR鑒定，其中引物序列分別為：AtU6-Fwd.5′-AGTCGAAGTAGTGATTGGATC-3′；M13fwd.5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′。20 μL PCR體系如下：2×EsTaq mix 10 μL,ddH2O 7.5 μL,模板1 μL,引物各0.75 μL。PCR程序如下：94 ℃ 7 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為188 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 山黧豆CASase基因DNA全長克隆

利用CTAB法提取萌發(fā)4 d山黧豆黃化苗根部DNA，根據(jù)山黧豆CASase基因cDNA全長序列(GenBank登錄號(hào):KJ563188)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，在2～4 kb有1條明顯亮帶(圖1)。

M.DL10000 Marker；1,2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL10000 Marker;1,2.PCR products圖1 山黧豆CASase基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of CASase gene in L.sativus via PCR

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后測(cè)序顯示，所獲片段長度為3 143 bp。在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列編碼山黧豆CASase，與目標(biāo)基因一致。利用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，山黧豆CASase基因與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、大豆、菜豆等物種的CASase基因聚在一支，而擬南芥、水稻和玉米的CSase基因聚在另一支，其中山黧豆CASase與蒺藜苜蓿和鷹嘴豆親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖2 山黧豆與其他物種CASase基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Homology analysis of DNA sequences of CASase gene from L.sativus and other plant species

2.2 山黧豆CASase基因序列分析及sgRNA的體外活性檢測(cè)

利用在線軟件Augustus對(duì)山黧豆CASase基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含10個(gè)外顯子(Exon)、8個(gè)內(nèi)含子(Intron)和1個(gè)外顯子間的間隔序列(圖3)。以山黧豆CASase基因前4個(gè)外顯子為靶序列區(qū)間，預(yù)測(cè)共有45個(gè)潛在sgRNA靶位點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行脫靶分析，從中優(yōu)選出5個(gè)sgRNA靶位點(diǎn),與可能的8個(gè)山黧豆半胱氨酸合成酶家族基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，潛在sgRNA靶位點(diǎn)在上述基因中的保守性較低，可以特異性地作用于山黧豆CASase基因,其具體位置見圖4。

圖3 山黧豆CASase基因的gDNA結(jié)構(gòu)Fig.3 gDNA structure of CASase gene in L.sativus

陰影間隔表示不同的外顯子，方框表示sgRNA靶位點(diǎn)所在位置Shade interval represents different exons.The box means the candidate targeting sequence sgRNA圖4 sgRNA靶位點(diǎn)在山黧豆CASase基因中所處的位置Fig.4 Location of candidate targeting sequence of sgRNA in CASase gene of L.sativus

進(jìn)一步應(yīng)用luciferase SSA重組法對(duì)設(shè)計(jì)的5個(gè)sgRNA進(jìn)行體外活性初篩，雙熒光檢測(cè)結(jié)果(圖5)表明，5個(gè)sgRNA均有效剪切了相應(yīng)的靶序列，其體外活性大小依次為sgRNA20r>sgRNA68r>sgRNA225f≈sgRNA256f>sgRNA396f。

圖5 山黧豆5條sgRNA體外活性的雙熒光酶報(bào)告基因檢測(cè)Fig.5 In vitro activity analysis of five sgRNAs from L.sativus via luciferase SSA

2.3 山黧豆CRISPR/Cas9基因敲除載體的構(gòu)建

取活性較高的sgRNA20r、sgRNA68r、sgRNA225f和sgRNA256f，退火連接到經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切的pPLatU6-sgRNA質(zhì)粒中。將重組pPLatU6-sgRNA載體進(jìn)行NheⅠ和KpnⅠ雙酶切，結(jié)果(圖6-A)顯示獲得長度為413 bp的片段。再利用XbaⅠ(與NheⅠ為同尾酶)和KpnⅠ雙酶切pPLHACas9載體，結(jié)果顯示酶切成功(圖6-B)。

M.1 kb plus DNA Marker；1,2.pPLatU6-sgRNA載體的NheⅠ和KpnⅠ雙酶切產(chǎn)物；3.pPLHACas9載體對(duì)照;4.pPLHACas9載體的XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切產(chǎn)物M.1 kb plus DNA Marker；1,2.pPLatU6-sgRNA restricted by NheⅠ and KpnⅠ;3.Control of pPLHACas9;4.pPLHACas9 restricted by XbaⅠ and KpnⅠ圖6 山黧豆pPLatU6-sgRNA載體(A)和pPLHACas9載體(B)的雙酶切檢測(cè)Fig.6 Restriction analysis of pPLatU6-sgRNA vector via NheⅠ and KpnⅠ (A) and pPLHACas9 vector via XbaⅠ and KpnⅠ (B)

凝膠回收上述目標(biāo)片段，插入到雙酶切后的pPLHACas9載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，22 ℃培養(yǎng)1 h后，涂Kan+平板篩選。挑選陽性克隆將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101并進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果(圖7)表明，pPLHACas9-sgRNA20r載體、pPLHACas9-sgRNA68r載體、pPLHACas9-sgRNA225f載體、pPLHACas9-sgRNA256f載體在200 bp左右都有特征條帶，說明上述載體均構(gòu)建成功。

M.1 kb plus DNA Marker；1.pPLHACas9-sgRNA20r載體；2.pPLHACas9-sgRNA68r載體；3.pPLHACas9-sgRNA225f載體；4.pPLHACas9-sgRNA256f載體M.1 kb plus DNA Marker;1.pPLHACas9-sgRNA20r;2.pPLHACas9-sgRNA68r;3.pPLHACas9-sgRNA225f;4.pPLHACas9-sgRNA256f圖7 山黧豆4個(gè)sgRNA靶位點(diǎn)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的陽性克隆PCR結(jié)果Fig.7 PCR identification of the Agrobacterium strain conta-ining CRZSPR/Casq vectors of CASase gene in L.sativus

3 討 論

有關(guān)山黧豆毒素β-ODAP的分離純化、定量檢測(cè)、毒理機(jī)制、生物合成及其與抗逆性的關(guān)系，已經(jīng)取得了一系列的研究成果[4,18]。近期的研究表明，β-ODAP與谷氨酸競(jìng)爭性結(jié)合離子型受體α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acidreceptor，AMPAR)，這會(huì)過度激活胞內(nèi)鈣離子流的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞過表達(dá)細(xì)胞膜表面的β1整合蛋白；并可進(jìn)一步導(dǎo)致黏著斑激酶(FAK)的磷酸化和樁蛋白過表達(dá)，使得肌動(dòng)蛋白微絲上大量聚合黏著斑單體，干擾細(xì)胞微絲的裝配，使其嚴(yán)重變形并最終破壞細(xì)胞骨架[19]。這些研究加深了對(duì)β-ODAP生物學(xué)功能的理解，然而，對(duì)于β-ODAP含量的分子調(diào)控機(jī)制仍然知之甚少。

Tripathy等[20]對(duì)具有不同β-ODAP含量的山黧豆進(jìn)行大量雜交后發(fā)現(xiàn)，至少有2個(gè)位點(diǎn)在β-ODAP的生物合成中具有重要作用。研究表明，山黧豆與硫營養(yǎng)比較豐富的谷類作物混合食用可以明顯減少中毒的發(fā)生[21]，而去除培養(yǎng)基中的Cys和Met等含硫氨基酸則會(huì)加劇β-ODAP對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)株系的損傷[22]。結(jié)合β-ODAP的生物合成途徑，Xu等[5]認(rèn)為，CASase是調(diào)控山黧豆毒素β-ODAP含量與硫代謝平衡的關(guān)鍵酶。由于CASase活性與β-ODAP的直接前體BIA的積累量呈顯著正相關(guān)[10-11]，因而，在基因水平上敲除或下調(diào)CASase基因可能會(huì)使β-ODAP含量下調(diào)，同時(shí)升高含硫氨基酸的水平。張明科等[16]構(gòu)建了山黧豆CASase基因RNAi載體，Li等[23]建立了山黧豆的高效離體再生體系，這均有利于調(diào)控CASase基因表達(dá)的進(jìn)一步研究。

本研究獲得了山黧豆CASase基因3 143 bp的DNA全長序列，設(shè)計(jì)并檢測(cè)了5個(gè)sgRNA靶位點(diǎn);利用酶切連接構(gòu)建了4個(gè)sgRNA靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因敲除載體，為進(jìn)一步敲除山黧豆CASase基因，篩選“低毒、高硫”山黧豆品系奠定了基礎(chǔ)。