郭素娟，武燕奇

(北京林業(yè)大學 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京100083)

干旱是限制植物正常生長發(fā)育的主要因子之一[1]。隨全球氣候變化，干旱越來越成為制約世界各國農(nóng)林業(yè)發(fā)展的重要因素[2]。葉片控制植物光合作用、水分蒸騰、氣體交換等生理活動，對植物的正常生長發(fā)育至關(guān)重要，因其長期暴露于自然環(huán)境中，因此對環(huán)境產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性[3-4]。干旱條件下，植物葉片的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一系列變化，這些變化有利于提高其對水分的利用效率，從而適應(yīng)干旱環(huán)境。

近年來，許多學者運用多元統(tǒng)計分析方法對葉片形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)與抗旱性的關(guān)系進行了研究[5]。如潘昕等[6]利用石蠟切片法對青藏高原25種灌木的抗旱性進行了評價。翟曉巧等[7]利用掃描電鏡法對8種落葉喬木的抗旱性進行了研究。張義等[8]利用石蠟切片法及指甲油印跡法對西寧市11種城市森林植物的抗旱性進行了評價。植物葉片包括上(下)表皮、柵欄組織、海綿組織、氣孔等結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究表明，氣孔密度、葉片厚度、柵欄組織厚度、緊密度等與抗旱性呈正相關(guān)關(guān)系；氣孔大小、氣孔開張度、海綿組織厚度、疏松度等與抗旱性呈負相關(guān)關(guān)系[9-12]。

板栗(CastaneamollissimaBl.)是重要經(jīng)濟林樹種之一，其堅果食用部分富含碳水化合物，并有蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，是我國重要的木本糧食物種，被譽為“鐵桿莊稼”，具有分布范圍廣、適應(yīng)能力強、果實品質(zhì)優(yōu)良、綜合利用價值高等特性，在國際市場上占有重要地位。目前有關(guān)板栗抗旱性的研究多集中于生理指標方面，如李鈞[13]研究了水分脅迫后板栗苗木丙二醛、脯胺酸、保護酶活性的變化；時忠杰等[14]、鄭龍等[15]、武燕奇等[16]以板栗苗木為對象，研究了MDA含量、SOD和POD活性、電導率等生理指標及根系形態(tài)指標對干旱脅迫的響應(yīng)情況。而關(guān)于板栗葉片解剖結(jié)構(gòu)特征及其與抗旱性關(guān)系的研究報道較少。為此，本研究以河北省遷西縣10個板栗品種(系)為試驗材料，分析其葉片解剖結(jié)構(gòu)及氣孔特征，綜合評價其抗旱性，以期為遷西地區(qū)抗旱板栗品種(系)的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于河北省遷西縣北京林業(yè)大學經(jīng)濟林(板栗)育種與栽培實踐基地，地處118°06′-118° 37′E，39°57′-40° 27′N，屬暖溫帶大陸性半濕潤季風氣候。試驗地年平均降水量804.2 mm，年最大降水量1 066.4 mm，年最小降水量428.4 mm；年平均氣溫10.1 ℃，7月份平均氣溫25 ℃，1 月份平均氣溫-7.8 ℃；無霜期一般為183 d。

1.2 試驗材料

在試驗地選取長勢良好、一致的大板紅(DBH)、燕龍(YL)、紫晶(ZJ)、遷西早紅(QXZH)、燕山短枝(YSDZ)、燕山早豐(YSZF)、紫珀(ZP)、燕奎(YK)、遷西晚紅(QXWH)和遷西壯栗(QXZL)等10個板栗品種(系)的7年生植株用于試驗。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 葉片解剖結(jié)構(gòu) 于2015年8月，對10個供試板栗品種(系)進行取樣。每品種(系)選取10株，取樹冠中上部向陽處的功能葉30片進行試驗。選擇晴天上午09:00-11:00進行取樣，以便于氣孔結(jié)構(gòu)的觀察。于葉片主脈兩側(cè)剪取0.5 cm×0.5 cm的小方塊，立即用FAA固定液固定，采用常規(guī)石蠟切片法[17]制作石蠟切片，每品種(系)20個重復。切片在Olympus DP72顯微鏡下進行觀察，并用Motic Image Advanced 3.0軟件對葉片厚度(X1)、上表皮角質(zhì)層厚度(X2)、上表皮厚度(X3)、下表皮厚度(X4)、下表皮角質(zhì)層厚度(X5)、柵欄組織厚度(X6)、海綿組織厚度(X7)等指標進行測量，每個視野重復30 次，并按照下列公式計算相關(guān)指標：

柵海比(X8)=柵欄組織厚度/海綿組織厚度。

葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度(X9)=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%。

葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度(X10)=海綿組織厚度/葉片厚度×100%。

1.3.2 氣孔特征 采樣及固定方法同1.3.1。采用指甲油印跡法[8]，先用橡皮將板栗葉片背面的星狀毛擦掉，涂一層透明指甲油，待其完全晾干后，用透明膠帶粘下一塊下表皮，置于載玻片上，每品種(系)20個重復，在Olympus DP72顯微鏡下進行觀察，并用Motic Image Advanced 3.0軟件對氣孔長度(X11)、氣孔寬度(X12)、氣孔開張寬度(X13)、氣孔開張長度(X14)、氣孔密度(X15)等指標進行測量，每個視野重復30次。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel和SPSS進行數(shù)據(jù)處理。利用主成分法、隸屬函數(shù)法、聚類分析法對各品種(系)抗旱性進行研究。

采用主成分分析法確定各指標的權(quán)重，加權(quán)求和得出板栗不同品種(系)抗旱性度量值(D)[16,18]，再根據(jù)10個品種(系)板栗的D值進行聚類分析。D計算公式為：

式中：R(Xij)表示i品種(系)j指標的隸屬函數(shù)值，Wj為指標j的權(quán)重。R(Xij)的計算公式[12]為：

R(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

如某一指標與抗旱性為負相關(guān)，則：

R(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：Xij表示i品種(系)j指標的測定值,Xmax及Xmin分別表示j指標的最大值及最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種(系)板栗葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的比較

植物葉片由于長期暴露在自然環(huán)境中，因此形態(tài)結(jié)構(gòu)特征可以反映其對環(huán)境的適應(yīng)性[5]。小而厚的葉片可以提高保水力，減少蒸騰面積。葉片上、下表皮可以起到減少水分蒸發(fā)的作用，上、下表皮越厚，則抗旱性越強。由表1可知，10個板栗品種(系)中，燕奎的葉片最厚(210.65 μm)，燕龍最薄(129.92 μm)；紫珀、大板紅、燕奎、遷西早紅、遷西晚紅之間及紫晶、燕山早豐、燕山短枝之間葉片厚度差異不顯著(P>0.05)，但均顯著大于遷西壯栗(P<0.05)，遷西壯栗顯著大于燕龍(P<0.05)。燕龍的上表皮角質(zhì)層最厚(12.61 μm)，遷西早紅最薄(4.70 μm)；紫晶、大板紅、燕龍之間及燕奎、燕山早豐、燕山短枝、遷西早紅、遷西晚紅、遷西壯栗之間上表皮角質(zhì)層厚度差異不顯著(P>0.05)，且以前面幾個品種較厚。大板紅的上表皮最厚(31.36 μm)，燕山早豐最薄(18.48 μm)，二者差異顯著(P<0.05)，其他品種間均無顯著差異。燕山早豐下表皮最厚(13.08 μm)，大板紅最薄(6.89 μm)，其他品種(系)間基本無顯著差異。燕山早豐的下表皮角質(zhì)層最厚(4.61 μm)，紫珀最薄(1.60 μm)，其他品種(系)間基本無顯著差異。

葉片柵欄組織中細胞排列緊密，可以減少水分蒸發(fā)，提高光合效率，進而增加植物的抗旱能力。海綿組織中細胞排列疏松，不利于水分的保持，影響植株的抗旱能力。葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度和海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度分別反映柵欄組織、海綿組織占葉片厚度的比例，可以表征抗旱性。由表1可知，在10個板栗品種(系)中，燕奎的柵欄組織厚度最厚(103.78 μm)，遷西壯栗最薄(40.67 μm)；紫晶、紫珀、大板紅、燕龍、燕奎、燕山短枝、遷西早紅之間及遷西晚紅、遷西壯栗之間柵欄組織厚度差異不顯著(P>0.05)，且前者顯著大于后者(P<0.05)。遷西晚紅的海綿組織最厚(117.24 μm)，紫晶最薄(51.52 μm)；紫珀、燕奎、燕山早豐、遷西早紅、遷西壯栗的海綿組織厚度顯著大于紫晶(P<0.05)，但顯著小于遷西晚紅(P<0.05)。紫晶的柵海比最大(1.84)，顯著大于其他品種(P<0.05)，遷西壯栗的最小(0.42)；大板紅、燕龍、燕奎、燕山短枝之間及遷西晚紅、遷西壯栗之間柵海比差異不顯著(P>0.05)。燕龍葉片的柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度最大(0.62)，顯著高于其他品種(系)，遷西晚紅最小(0.25)；紫晶、大板紅、燕奎、燕山短枝之間及遷西晚紅、遷西壯栗之間柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度差異不顯著(P>0.05)。遷西晚紅葉片的海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度最大(0.60)，紫晶最小(0.30)；紫晶、大板紅、燕山短枝之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于其他品種(P<0.05)；遷西晚紅、遷西壯栗之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他品種(P<0.05)。

表1 10個品種(系)板栗葉片的解剖結(jié)構(gòu)特征Table 1 Leaf anatomical structure characteristics of ten varieties (clones) of Chinese chestnut

注：X1.葉片厚度；X2.上表皮角質(zhì)層厚度；X3.上表皮厚度；X4.下表皮厚度；X5.下表皮角質(zhì)層厚度；X6.柵欄組織厚度；X7.海綿組織厚度；X8.柵海比；X9.葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度；X10.葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度。同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示在P=0.05水平存在顯著性差異(Duncan’s法)。下表同。
Note:X1.Thickness of leaves；X2.Cuticle thickness of upper epidermis；X3.Thickness of upper epidermis；X4.Thickness of lower epidermis；X5.Cuticle thickness of lower epidermis；X6.Thickness of palisade tissue；X7.Thickness of spongy tissue；X8.Ratio of palisade tissue to spongy tissue；X9.Leaves compactness；X10.Leaves compactness and porosity.Different lowercase letters in each column mean significant difference atP=0.05 level (Duncan’s).The same below.

2.2 不同板栗品種(系)葉片氣孔特征的比較

葉片上氣孔的大小、密度及開張程度影響水分的蒸騰速率，氣孔小而密且開張程度較小可以減少水分蒸騰耗散，提高其抗旱性。由表2可知，10個板栗品種(系)中，遷西早紅葉片氣孔長度最大(24.28 μm)，燕龍最小(18.17 μm)，二者差異顯著(P<0.05)。大板紅的葉片氣孔寬度最大(20.90 μm)，燕龍最小(16.59 μm)，顯著小于除紫晶、燕奎外的其他品種(P<0.05)。紫晶的葉片氣孔開張寬度最大(7.74 μm)，遷西晚紅最小(2.39 μm)；紫晶、遷西早紅之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他品種(P<0.05)。10個板栗品種(系)的葉片氣孔開張長度差異不顯著(P>0.05)，以燕山早豐最大(13.00 μm)，遷西晚紅最小(10.17 μm)。燕山早豐的葉片氣孔密度最大(1 000.73 mm-2)，遷西壯栗最小(648.48 mm-2)；紫晶、大板紅、燕奎、燕山短枝、遷西早紅、遷西晚紅之間差異不顯著(P>0.05)，紫珀、遷西壯栗之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 板栗抗旱指標權(quán)重的確定

10個板栗品種(系)所測15項指標之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，反映的信息有一定重疊，不能直接用來分析抗旱性。因此，本試驗通過主成分分析確定15項指標反映抗旱性時所占的權(quán)重，結(jié)果見表3。由表3可知，第1主成分貢獻率為40.41%，其中上表皮角質(zhì)層厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比、葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度、葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度、下表皮厚度等在第1主成分上載荷較高，表明上表皮角質(zhì)層、上表皮、柵欄組織越厚，柵海比、葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度越大，葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度越小，板栗抗旱性越強。第2主成分貢獻率為17.58%，其中葉片厚度、氣孔密度在第2主成分上載荷較高，表明葉片越厚，氣孔密度越大，抗旱能力越強。第3主成分貢獻率為16.13%，其中氣孔長度、氣孔開張長度在第3主成分上載荷較高。第4主成分貢獻率為11.06%，下表皮角質(zhì)層厚度、氣孔寬度、氣孔開張寬度在第4主成分上載荷較高。氣孔是植物吸收CO2、散失水分的通道，氣孔大小、氣孔開張度與抗旱性存在一定關(guān)系。第5主成分貢獻率為8.06%，葉片厚度在第5主成分上載荷較高。5個主成分貢獻率累計達到93.25%，與抗旱能力相關(guān)性大，因此提取前5個主成分分析板栗的抗旱性。

表2 10個品種(系)板栗葉片的氣孔特征Table 2 Leaf stomatal structure characteristics of varieties(clones)of ten Chinese chestnut

注：X11.氣孔長度；X12.氣孔寬度；X13.氣孔開張寬度；X14.氣孔開張長度；X15.氣孔密度。
Note:X11.Stomatal length；X12.Stomatal width；X13.Stomatal aperture width；X14.Stomatal aperture length；X15.Stomatal density.

表3 10個板栗品種(系)15項指標的主成分分析Table 3 Principal component analysis of 15 indexes of ten varieties (clones) of Chinese chestnut

注：X1～X15所代表的指標與表1和表2相同。表4同。
Note:The indexes ofX1-X15are the same as Table 1,Table 2,and Table 4.

根據(jù)主成分載荷矩陣求得主成分F1、F2、F3、F4、F5的表達式分別為：

F1=-0.04X1+0.29X2+0.24X3-0.29X4-0.08X5+0.34X6-0.35X7+0.39X8+0.39X9-0.33X10-0.19X11-0.19X12+0.18X13-0.04X14+0.09X15。

F2=0.44X1-0.29X2+0.26X3-0.03X4-0.29X5+0.21X6+0.11X8-0.10X9-0.26X10+0.35X11+0.31X12+0.02X13-0.13X14-0.44X15。

F3=-0.08X1-0.23X2-0.16X3+0.27X4+0.28X5+0.08X6-0.23X7+0.11X8+0.10X9-0.18X10+0.38X11+0.17X12+0.31X13+0.59X14+0.20X15。

F4=0.24X1+0.02X2+0.16X3-0.17X4+0.51X5+0.12X6+0.04X7+0.04X8+0.02X9-0.12X10+0.40X12-0.51X13-0.12X14+0.41X15。

F5=0.55X1-0.24X2-0.44X3+0.15X4+0.09X5+0.31X6+0.24X7+0.06X8+0.04X9-0.10X10-0.24X11-0.39X12+0.09X13-0.08X14+0.15X15。

根據(jù)5個主成分的權(quán)重，求得主成分F的表達式為：

F=(λ1F1+λ2F2+λ3F3+λ4F4+λ5F5)/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)。

式中：λ1、λ2、λ3、λ4、λ5分別為5個主成分的特征根。

即：

F=0.13X1+0.01X2+0.11X3-0.09X4+0.03X5+0.24X6-0.17X7+0.22X8+0.17X9-0.25X10+0.03X11+0.02X12+0.08X13+0.04X14+0.05X15。

上述表達式中，指標前數(shù)值越大，表示權(quán)重越大，越能反映板栗抗旱性。由此可知，15項指標反映板栗抗旱性能力的順序為：葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度(0.25)>柵欄組織厚度(0.24)>柵海比(0.22)>葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度(0.17)>海綿組織厚度(0.17)>葉片厚度(0.13)>上表皮厚度(0.11)>下表皮厚度(0.09)>氣孔開張寬度(0.08)>氣孔密度(0.05)>氣孔開張長度(0.04)>氣孔長度(0.03)=下表皮角質(zhì)層厚度(0.03)>氣孔寬度(0.02)>上表皮角質(zhì)層厚度(0.01)。

2.4 10個板栗品種(系)抗旱性的隸屬函數(shù)分析及綜合評價

根據(jù)隸屬函數(shù)法，求得10個板栗品種(系)不同指標的隸屬函數(shù)值，結(jié)合主成分分析法求出的各指標權(quán)重，綜合計算抗旱性度量值(表4)，據(jù)此對抗旱性進行排序。由表4可知，抗旱性度量值最大的品種為大板紅(1.27)，最小的為遷西壯栗(0.36)。10個板栗品種(系)的抗旱性排序為：大板紅(1.27)>紫晶(1.24)>燕龍(1.13)>燕奎(1.13)>燕山短枝(0.94)>燕山早豐(0.94)>紫珀(0.90)>遷西晚紅(0.84)>遷西早紅(0.44)>遷西壯栗(0.36)。

表4 10個品種(系)板栗抗旱性的隸屬函數(shù)值和抗旱性度量值(D)Table 4 Subjection function values, index weights and drought resistance values(D) of ten varieties(clones)of Chinese chestnut

2.5 10個板栗品種(系)抗旱性的聚類分析

依據(jù)板栗的抗旱性度量值，對10個品種(系)進行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，10個板栗品種(系)按抗旱性強弱可以分為3類，其中第1類抗旱性強，品種(系)有紫晶、大板紅、燕龍、燕奎；第2類抗旱性中等，品種(系)有紫珀、燕山短枝、燕山早豐、遷西晚紅；第3類抗旱性較弱，品種(系)有遷西早紅、遷西壯栗。

圖1 10個板栗品種(系)抗旱性的聚類分析Fig.1 Clustering analysis on drought stress resistance of ten Chinese chestnut varieties (clones)

3 討論與結(jié)論

葉片的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)是葉片與環(huán)境條件長期作用的結(jié)果[19]，其可較好地反映植物對干旱等逆境條件的適應(yīng)性。相關(guān)研究表明，較厚的葉片有利于水分的保存，因此抗旱性較強[20]。劉捷平[21]、薛智德等[22]認為，葉片角質(zhì)層可以減少水分的蒸發(fā)，增加對光照的折射率，起到一定的抗旱作用。劉紅茹等[23]發(fā)現(xiàn)，葉片表皮越厚，越不利于水分散失，植物抗旱性越強。徐揚等[24]認為，葉片柵欄組織的緊密結(jié)構(gòu)，有利于水分的儲存，且其中含有大量的葉綠體，有利于光合作用的進行，因而柵欄組織越發(fā)達，植株的抗旱性越強；海綿組織中結(jié)構(gòu)疏松，有利于水分散失；植物葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度越大或葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度越小，則柵欄組織所占的比例越大，植株越抗旱。本研究中，10個板栗品種(系)抗旱機制不同，其中紫晶通過提高柵欄組織與海綿組織的比值來抵御干旱環(huán)境；大板紅通過增加葉片上表皮及柵欄組織厚度來提高抗旱性；燕龍通過增加葉片角質(zhì)層厚度及葉片中柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度來抵御旱害；燕奎通過增加葉片厚度及柵欄組織厚度來提高抗旱性；燕山早豐通過增加下表皮及下角質(zhì)層厚度來抵御干旱。

相關(guān)研究表明，氣孔小而多者，抗旱性強，這是因為一方面水分充足時可以提高光合效率，另一方面水分缺乏時可以減少水分散失[7,11,25-26]。但也有學者認為，氣孔少，反而抗旱性弱，因為氣孔密度與氣體交換阻力成反比，氣孔密度小，氣體交換阻力增大，蒸騰作用減小[27]。本研究結(jié)果表明，抗旱性較強的燕龍葉片表皮氣孔長度、寬度較小，而抗旱性較差的遷西早紅、遷西壯栗葉片表皮氣孔長度較大，抗旱性較強的紫晶氣孔開張寬度最大，這可能是因為不同品種(系)在干旱環(huán)境中采取的抗旱機制不同。結(jié)合葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，燕龍上表皮角質(zhì)層較厚，氣孔較小而密度較大，說明其抗旱機制除了增加葉片角質(zhì)層厚度及葉片中柵欄組織比例外，還包括控制氣孔大小和密度；燕奎葉片厚度、柵欄組織較厚，氣孔較小，說明其除了增加葉片厚度及柵欄組織厚度外，也通過控制氣孔大小來抵御干旱；燕山早豐下表皮及下表皮角質(zhì)層較厚，氣孔密度最大，說明其除了增加表皮及角質(zhì)層厚度外，也通過控制氣孔密度來抵御干旱。

10個板栗品種(系)葉片各項指標的大小順序并不一致，可見在研究抗旱性時，不能單憑某一項指標來進行評價[27-31]。因此，采用基于多項指標的隸屬函數(shù)法進行抗旱性研究具有一定的可行性。同時，根據(jù)主成分分析確定各指標的權(quán)重，可提高抗旱性評價的準確性。本試驗通過分析得出，所選擇的15項指標反映抗旱性的能力并不相同，從大到小的順序為：葉片海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度、柵欄組織厚度、柵海比、葉片柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度、海綿組織厚度、葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、氣孔開張寬度、氣孔密度、氣孔開張長度、氣孔長度、下表皮角質(zhì)層厚度、氣孔寬度、上表皮角質(zhì)層厚度。聚類分析表明，10個板栗品種(系)可分為3個類型，抗旱性強者為紫晶、大板紅、燕龍、燕奎；抗旱性中的為紫珀、燕山短枝、燕山早豐、遷西晚紅；抗旱性弱的為遷西早紅、遷西壯栗。

綜上所述，葉片解剖結(jié)構(gòu)指標能較好地反映板栗的抗旱特性，可用于板栗抗旱性的鑒定與評價。本研究選擇的10個板栗品種(系)中，紫晶、大板紅、燕龍、燕奎的抗旱性最強，可在遷西地區(qū)廣泛種植。