林寶妹，邱珊蓮，張少平，林巧莉，鄭開斌

(福建省農(nóng)業(yè)科學院 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005)

嘉寶果(MyrciariacaulifloraBerg)又名擬愛神木、樹葡萄，為桃金娘科擬香桃木屬果樹，是一種生長緩慢的熱帶、亞熱帶常綠喬木或灌木,原產(chǎn)于巴西，在玻利維亞、巴拉圭、阿根廷東北部、烏拉圭、秘魯?shù)鹊匾灿蟹植糩1-2]。嘉寶果在我國臺灣地區(qū)引種較早，始于20世紀80年代末，大陸地區(qū)于2003年從臺灣嘉義引進，目前已發(fā)展成新興的熱帶水果。嘉寶果樹枝葉繁茂，一年可4次開花結(jié)果，花果著生于樹干或枝條上，觀賞性強。嘉寶果果實圓潤小巧呈深紫色，皮厚且多纖維，果肉多汁、甘甜，其中含有多種芳香成分，如萜烯類、有機酸類、醇類等，因此果實香氣四溢[3-5]；果實低糖低脂，含有多種人體所需營養(yǎng)元素、礦物質(zhì)及微量元素，如鈣、磷、鐵、Vc、氨基酸等，可鮮食，還可制成果醬、果酒、果醋等營養(yǎng)保健品，價格高昂，具有良好的經(jīng)濟效益[4-7]。另外，嘉寶果果實含有豐富的花青素、類黃酮、酚酸、單寧以及較少見的縮酚酸等酚類物質(zhì)，因此具有良好的抗氧化、抗炎、降低膽固醇水平、抗惡性腫瘤細胞增殖、降低血糖等生物活性，可用于治療慢性炎癥疾病、糖尿病、高血脂等[8-12]。綜上所述，嘉寶果是一種集觀賞、食用、經(jīng)濟、藥用等多種價值于一體的名貴優(yōu)良樹種，極具開發(fā)研究價值。

近年來，隨著人們對自由基破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，抗氧化劑研究越來越受到關(guān)注。抗氧化劑可以抑制自由基的產(chǎn)生及其氧化作用，保護生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等[13]，防止或延緩許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，如糖尿病及其并發(fā)癥。目前常用的抗氧化劑多為人工合成，存在安全性及毒性問題。因此，從植物中尋找安全有效的天然抗氧化劑已成為發(fā)展趨勢和研究熱點。國內(nèi)外的研究結(jié)果表明，嘉寶果樹的果實、果皮和種子等具有良好的抗氧化性[12,14-16]，但是對嘉寶果葉片的抗氧化作用尚未見報道。本試驗選取嘉寶果樹4個品種的嫩/老葉作為研究對象，分別用水和不同體積分數(shù)乙醇進行提取，檢測提取物的總多酚和總黃酮含量及抗氧化活性，探討總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性，以期能篩選出具有較強抗氧化活性的品種和提取液，為嘉寶果樹葉的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2016-12-2017-04在福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所進行。供試嘉寶果品種有沙巴、四季早生、福岡、阿根廷，樹齡5年。2016-12-08在福建龍海市惠昌樹葡萄專業(yè)合作社采樣，各嘉寶果品種隨機選取9株，分別剪取嫩葉(枝條頂部、質(zhì)地柔嫩且葉脈不清晰者)和老葉(枝條近樹干側(cè)、質(zhì)地較硬且葉脈清晰者)，備用。1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)、鄰二氮菲(P9375-5G)，購于美國Sigma公司；標準品沒食子酸、蘆丁，購于日本東京化成工業(yè)株式會社；抗壞血酸(Vc)、無水乙醇、95%乙醇(體積分數(shù)，下同)、雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 設備和儀器

紫外可見分光光度計，L5S型，上海儀電分析儀器有限公司；超純水機，UPW-20N型，北京歷元電子儀器有限公司；分析天平，BS110S型，德國Sartorius集團；水浴鍋，HH·S21-8-S型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；臺式冷凍恒溫振蕩器，THZ-C-1型，蘇州培英實驗設備有限公司；粉碎機，WBL2521H型，佛山美的集團；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱，GZX-9246MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 嘉寶果葉片提取液的制備 將采集的嘉寶果新鮮葉片用粉碎機粉碎1 min(28 000 r/min)，取適量粉碎樣品與不同溶劑(水、體積分數(shù)50%和70%乙醇、無水乙醇)按1∶10的質(zhì)量(g)體積(mL)比混合，在搖床(30 ℃，180 r/min)中振蕩提取16 h，再以6 000 r/min離心15 min，取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至冷凝管中無溶劑滴出為止。濃縮液用水溶解定容至10 mL，未見沉淀，4 ℃保存，待測。另取一部分葉片，稱其鮮質(zhì)量后，烘干至恒質(zhì)量，計算干物質(zhì)占比。樣品質(zhì)量濃度以每毫升水溶液含有的新鮮葉片質(zhì)量計，單位為mg/mL。

1.3.2 總多酚含量的測定 參照劉禹等[17]的方法并作適當修改進行試驗。取0.1 mL樣品液，加入0.1 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu試劑和2.8 mL水，混勻，靜置8 min后加入2 mL 75 g/L碳酸鈉溶液，搖勻，室溫下密封避光2 h，于765 nm處測其吸光度(D765 nm)，平行測定3次。以沒食子酸為標準品，建立方程：y=0.002x+0.061(R2=0.995 2)；式中：y為D765 nm值，x為沒食子酸質(zhì)量濃度(0～300 μg/mL)。不同提取液中多酚含量用每克干燥葉片中所含的相當于沒食子酸(GAE)的量進行計算，單位為mg/g。試驗重復3次。

1.3.3 總黃酮含量的測定 參照劉禹等[17]的方法并作適當修改進行試驗。取1 mL樣品液，加入0.5 mL 50 g/L亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min后加入0.5 mL 100 g/L硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，然后加入4 mL 40 g/L氫氧化鈉溶液，最后加入水定容至10 mL，靜置15 min，于510 nm處測其吸光度(D510 nm)，平行測定3次。以蘆丁為標準品，建立方程：y=1.250x-0.001(R2=0.999 9)；式中：y為D510 nm值，x為蘆丁質(zhì)量濃度(0～60 μg/mL)。不同提取液中總黃酮含量用每克干燥葉片中所含的相當于蘆丁(RE)的量進行計算，單位為 mg/g。試驗重復3次。

1.3.4 抗氧化活性的測定 DPPH·自由基清除能力的測定參照Li等[18]的方法并稍作改動進行試驗。DPPH·溶劑為體積分數(shù)95%乙醇，以抗壞血酸為對照品，建立方程：y=948.763x+1.626 (R2=0.996 6),式中：y為DPPH·自由基清除率，x為抗壞血酸質(zhì)量濃度(20～100 μg/mL)。羥自由基(·OH)清除能力的測定參照Caillet等[19]的鄰二氮菲法，以抗壞血酸為對照品，建立方程：y=31.298x-33.209(R2=0.996 8),式中：y為·OH自由基清除率，x為抗壞血酸質(zhì)量濃度(1.800～3.600 mg/mL)。ABTS+自由基清除能力的測定采用Hu等[20]的方法，以抗壞血酸為對照品，建立方程：y=596.050x+3.274(R2=0.999 5),式中：y為ABTS+自由基清除率，x為抗壞血酸質(zhì)量濃度(20～100 μg/mL)。自由基清除試驗中樣品均設5個濃度梯度，最高濃度設定為使自由基清除率達50%～100%的濃度，最低濃度設定為使自由基清除率達0～20%的濃度。以樣品質(zhì)量濃度為自變量，自由基清除率為因變量，繪制回歸曲線，求回歸方程，計算自由基清除率為50%時的樣品濃度，最終以樣品干質(zhì)量濃度表示半數(shù)清除濃度(EC50)，每組試驗重復3次。自由基清除率的計算公式如下：

DPPH·清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

式中：A0為對照管D517 nm值，Ai為樣品管D517 nm值，Aj為樣品本底D517 nm值。

·OH清除率=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%。

式中：A0為未損傷管D510 nm值，A2為樣品管D510 nm值，A1為損傷管D510 nm；

ABTS+清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

式中：A0為對照管D734 nm值，Ai為樣品管D734 nm，Aj為樣品本底D734 nm值。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行提取物總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性分析和單因素方差分析。數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種嘉寶果葉片提取物中的總多酚含量

不同品種嘉寶果葉片的干物質(zhì)百分比見表1。根據(jù)表1 數(shù)據(jù)計算樣品總多酚含量，結(jié)果見表2。

表1 不同品種嘉寶果葉片干物質(zhì)的百分比Table 1 Dry weight ratios of leaves from different cultivars of Jaboticaba %

表2結(jié)果表明，無論用哪種溶劑提取，各嘉寶果品種嫩葉的總多酚含量均高于同品種老葉，最高的為沙巴嫩葉(273.70 mg/g)；各嘉寶果品種嫩葉總多酚含量為0.12～273.70 mg/g，老葉為6.82～151.55 mg/g，4個品種老葉水提取物中均未檢測到總多酚。由表2可見，各嘉寶果品種葉片提取物中的總多酚含量均表現(xiàn)為醇提取物極顯著高于水提取物(P<0.01)，總多酚含量高低依次表現(xiàn)為 70%乙醇提取物>50%乙醇提取物>無水乙醇提取物>水提取物。4個嘉寶果品種，70%和50%乙醇提取物總多酚含量的變化規(guī)律一致，由高到低依次表現(xiàn)為沙巴嫩葉>四季早生嫩葉>阿根廷嫩葉>四季早生老葉>福岡嫩葉>阿根廷老葉>沙巴老葉>福岡老葉；無水乙醇提取物中總多酚含量以沙巴嫩葉最高，沙巴老葉最低；水提取物總多酚含量以沙巴嫩葉最高，阿根廷嫩葉最低。

表2 4個品種嘉寶果葉片不同溶劑提取物中的總多酚含量比較 Table 2 Comparison of total polyphenols (TP) contents of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars mg/g

注：-表示未測到。同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。
Note:-Means not detected.Different small letters in the same column indicate significant different at 0.05 level (P<0.05) and different capital letters in the same column indicate significant different at 0.01 level (P<0.01).The same below.

2.2 不同品種嘉寶果葉片提取物中的總黃酮含量

表3結(jié)果表明，無論用哪種溶劑提取，各嘉寶果品種嫩葉的總黃酮含量均高于同品種老葉，總黃酮含量最高為阿根廷嫩葉(213.45 mg/g)；嫩葉總黃酮含量為23.12～213.45 mg/g，老葉為6.28～130.65 mg/g。

由表3可見，各嘉寶果品種均表現(xiàn)為醇提取物中總黃酮含量高于水提取物，醇提取物中總黃酮含量以阿根廷嫩葉最高，其次為四季早生嫩葉；水提取物中總黃酮含量以沙巴嫩葉最高，其次為四季早生嫩葉。除沙巴嫩葉、四季早生嫩葉和福岡老葉外，其他葉片各溶劑提取物總黃酮含量均表現(xiàn)為：70%乙醇提取物>50%乙醇提取物>無水乙醇提取物>水提取物。

表3 4個品種嘉寶果葉片不同溶劑提取物中的總黃酮含量比較Table 3 Comparison of total flavonoid (TF) contents of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars mg/g

2.3 不同品種嘉寶果葉片提取物對DPPH·自由基的清除能力

不同品種嘉寶果葉片提取物對DPPH·自由基的清除效果見表4。表4表明，4個品種葉片不同溶劑提取物均對DPPH·自由基有一定的清除效果，同品種嫩葉提取物對DPPH·自由基的清除能力均高于老葉，線性相關(guān)系數(shù)0.960 450%乙醇提取物>無水乙醇提取物>水提取物。對同一種溶劑提取所獲的8種樣品進行比較發(fā)現(xiàn)，4種溶劑中均以沙巴嫩葉提取物抗氧化活性最高，其70%乙醇提取物對DPPH·自由基的清除能力(EC50=0.093 g/L)最強，50%乙醇提取物(EC50=0.100 g/L)次之，與現(xiàn)在普遍接受的抗氧化劑抗壞血酸(EC50=0.051 g/L)相比，沙巴嫩葉70%和50%乙醇提取物對DPPH·自由基的清除能力約是其50%，說明沙巴嫩葉70%和50%乙醇提取物具有較強的抗氧化活性。在醇提取物中，以沙巴老葉無水乙醇提取物對DPPH·自由基的清除能力最弱(EC50=1.409 g/L)；在所有提取物中，四季早生老葉水提取物對DPPH·自由基的清除能力最弱(EC50=19.289 g/L)。

表4 4種嘉寶果葉片不同溶劑提取物清除DPPH·自由基效果的比較Table 4 Comparison of scavenging effects on DPPH·radical of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars

注：回歸方程中，x表示樣品質(zhì)量濃度，y表示自由基清除率。下表同。
Note:In the regression equation,xrepresents the concentration of sample andyrepresents the scavenging rate of free radical.The same below.

2.4 不同品種嘉寶果葉片提取物對·OH自由基的清除能力

不同品種嘉寶果葉片提取物對·OH自由基的清除效果見表5。由表5可見，除沙巴老葉、四季早生嫩葉外，其余葉片不同溶劑提取物清除·OH自由基的能力大小依次表現(xiàn)為：50%乙醇提取物>70%乙醇提取物>無水乙醇提取物>水提取物。沙巴嫩葉50%和70%醇提取物清除·OH自由基的能力最強，EC50均為0.128 g/L，遠超現(xiàn)在普遍接受的抗氧化劑抗壞血酸對·OH自由基的清除能力(EC50=2.659 g/L)。此外，沙巴嫩葉、四季早生嫩葉、福岡嫩葉水提取物對·OH自由基的清除能力也都高于抗壞血酸。

表5 4種嘉寶果葉片不同溶劑提取物清除·OH自由基效果的比較Table 5 Comparison of scavenging effects on ·OH radical of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars

2.5 不同品種嘉寶果葉片提取物對ABTS+自由基的清除能力

不同品種嘉寶果葉片提取物對ABTS+自由基的清除效果見表6。由表6可見，與·OH自由基的清除能力結(jié)果相似，4個品種葉片不同溶劑提取物對ABTS+自由基的清除能力由大到小依次表現(xiàn)為：50%乙醇提取物>70%乙醇提取物>無水乙醇提取物>水提取物。所有樣品中，以沙巴嫩葉50%乙醇提取物效果最佳(EC50=0.142 g/L)，沙巴嫩葉70%乙醇提取物次之(EC50=0.150 g/L)，四季早生老葉水提取物效果最差(EC50=16.943 g/L)。

表6 4種嘉寶果葉片不同溶劑提取物清除ABTS+自由基效果的比較Table 6 Comparison of scavenging effects on ABTS+ radical of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars

表6(續(xù)) Contined table 6

2.6 總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性

4個品種嘉寶果葉片提取物總多酚、總黃酮含量與其抗氧化活性的相關(guān)性見表7。表7表明，所有葉片醇提取物總多酚含量與DPPH·、·OH、ABTS+自由基清除能力均呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)；水提取物總多酚含量僅與ABTS+自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)。無水乙醇提取物總黃酮含量與ABTS+、DPPH·自由基清除能力極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與·OH自由基清除能力顯著正相關(guān)(P<0.05)；50%乙醇提取物總黃酮含量僅與ABTS+自由基清除能力顯著正相關(guān)(P<0.05)；水提取物總黃酮含量僅與ABTS+、DPPH·自由基清除能力顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表7 嘉寶果葉片提取物中總多酚和總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 7 Correlation between total polyphenols and total flavonoids and the antioxidant activities of extracts of Jaboticabal leaves

注：*表示相關(guān)性顯著(P<0.05)； **表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)。
Note: * Means significant correlation at 0.05 level (P<0.05);** Means significant correlation at 0.01 level (P<0.01).

3 討論與結(jié)論

本研究對采自同一農(nóng)場的4個品種嘉寶果嫩/老葉分別用無水乙醇、70%乙醇、50%乙醇和水提取，共獲得32個提取液樣品，比較其總多酚、總黃酮含量和抗氧化活性。結(jié)果表明，同一品種嫩葉的總多酚、總黃酮含量均高于老葉。潘劍用等[21]在研究桑葉抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)，桑樹上部葉的功能成分含量如多酚、黃酮和多糖等均比中部葉和下部葉高。陳明等[22]檢測了6個品種費約果葉片甲醇提取物的多酚含量時，也得出嫩葉的多酚含量均較成熟葉高的結(jié)論，但總黃酮含量在成熟葉中較高，這與本研究稍有不同。植物在幼嫩期具有更高總多酚含量的特征在藍莓[23]、沙棗[24]、草莓[25]等植物中也有發(fā)現(xiàn)。值得一提的是，Alezandro等[26]按照嘉寶果的果皮顏色將果實分為綠色期、淡粉期、紅色期、深紅期、黑紫期等5個成熟期，測定5個成熟期果實的總多酚含量、DPPH·自由基清除能力和亞鐵還原能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色期的果實總多酚含量、DPPH·自由基清除能力和亞鐵還原能力最高，黑紫期的果實最低，結(jié)合本研究結(jié)果可知，嘉寶果葉片和果實成熟度對多酚含量都有明顯影響，幼嫩時期的果實和葉片多酚含量較高。羅婭等[27]研究發(fā)現(xiàn)，植物的基因型顯著影響不同品種費約果葉片的總多酚和原花青素含量；不同品種的油橄欖葉總多酚含量存在差異[28]。因此筆者推測，嘉寶果不同品種間總多酚與總黃酮的含量差異，可能是受遺傳因素影響所致。

不同溶劑對提取物化學組成及含量有很大影響[29-31]，如鹿銜草的甲醇提取物總多酚含量高于氯仿和石油醚提取物[32]，連翹葉乙醇提取物總多酚含量高于乙酸乙酯和水提取物[33]。有報道指出，75%乙醇具有較強的破壁能力，可以有效穿透植物細胞壁，有助于充分提取植物有效成分[34]。本研究中，各樣品70%乙醇提取物中總多酚含量均高于其他溶劑提取物。本研究發(fā)現(xiàn)，4個品種嘉寶果葉片不同溶劑提取物對DPPH·、ABTS+清除能力低于抗壞血酸，而對·OH的清除能力則遠高于抗壞血酸，其中以50%和70%乙醇提取物的抗氧化性最佳，水提取物最差；50%和70%乙醇提取物總多酚、總黃酮含量明顯高于無水乙醇和水提取物，表明50%～70%乙醇溶液能更好地溶出嘉寶果葉片中的多酚和黃酮類物質(zhì)。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，各嘉寶果品種醇提取物對DPPH·、ABTS+、·OH 等3種自由基的清除能力與總多酚含量均呈極顯著相關(guān)性，總多酚含量高則對自由基的半數(shù)清除濃度低，顯示出更高的抗氧化能力。有關(guān)紅薯葉的研究表明，不同溶劑紅薯葉提取物以乙酸乙酯層總多酚含量最高，其對DPPH·、ABTS+自由基的清除能力以及對ORAC氧自由基的吸收能力均大于其他溶劑提取物[35]；藍莓各部位對·OH自由基的清除能力和鐵還原能力隨總多酚質(zhì)量濃度的提高而升高，表現(xiàn)出正相關(guān)性[23]；馬利華等[36]研究顯示，相比水、三氯甲烷及乙酸乙酯3種溶劑，70%乙醇牛蒡皮提取液中總多酚含量最高，對DPPH·、·OH自由基的清除能力也最強。上述研究結(jié)果均與本研究類似。本研究發(fā)現(xiàn)，無水乙醇提取物對DPPH·、ABTS+和·OH 3種自由基的清除能力與總黃酮含量顯著相關(guān)；50%乙醇提取物僅對ABTS+自由基清除能力與總黃酮含量顯著相關(guān)；水提取物對DPPH·、ABTS+2種自由基的清除能力與總黃酮含量顯著相關(guān)；而70%乙醇提取物的自由基清除能力與總黃酮含量無明顯相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，薄荷不同溶劑提取物清除DPPH·、ABTS+和鐵離子還原能力與黃酮含量相關(guān)性較小[37]，這與本研究結(jié)果類似。鐵皮石斛提取物對DPPH·、ABTS+的清除能力與總黃酮含量相關(guān)性較強，對·OH的清除能力則與總多酚含量顯著相關(guān)[38]。說明總多酚和總黃酮含量均能夠影響提取物的抗氧化活性，而嘉寶果葉片提取物抗氧化活性的差異主要來源于各提取物中總多酚含量的差異，總黃酮含量對抗氧化活性影響較小。

本研究中，沙巴嫩葉4種溶劑提取液的抗氧化活性以及總多酚含量均優(yōu)于其他品種，總多酚含量高達273.70 mg/g，約占已報道的嘉寶果果皮總多酚含量(556.3 g/kg)的50%[12]，與青茶中的盛華茗茶茶總多酚含量相當(277.47 g/kg)，而高于其他10種茶葉茶總多酚含量，如金駿眉、鐵觀音、大紅袍等[39]。

綜上，本研究不同品種嘉寶果葉片總多酚和總黃酮含量存在明顯差異；同一品種嫩葉的抗氧化性以及總多酚、總黃酮含量高于老葉；50%和70%乙醇提取物的總多酚、總黃酮含量及抗氧化活性優(yōu)于無水乙醇和水提取物；醇提取物抗氧化性與總多酚含量極顯著正相關(guān)；所有樣品中，沙巴嫩葉的總多酚含量和抗氧化能力最優(yōu)。但提取物中發(fā)揮抗氧化活性的主要成分以及不同成分之間是否存在協(xié)同作用，有待進一步研究。