李小杭,鄭年豐,韓守法

(廈門大學化學化工學院,福建 廈門 361005)

細菌的生命活動經常受外界環(huán)境變化的影響．在各種環(huán)境因素中,酸性是影響細菌生存的不利因素[1]．一些細菌進化后形成了有效的機制來降低苛刻酸性環(huán)境的影響，如腸道細菌能夠有效地通過極度酸性的胃并引起宿主的腸道感染[2]．據(jù)報道,細菌能夠通過自我調節(jié)使細胞溶質在酸性環(huán)境中保持較高的pH[3],有助于它在通過人的胃時能夠幸存下來．細菌內部pH對細菌細胞的生長、鈣調節(jié)、內吞作用、趨藥性、細胞黏附等過程有至關重要的影響[4],因此測定細菌內部pH變化對于研究其耐酸性機制、致病機理及預防有害細菌感染等方面具有重要意義．

目前,已有一些方法應用于響應細菌內部pH的變化,如:利用遺傳密碼的擴張策略將非天然氨基酸整合到特定蛋白,再通過生物正交結合引入一個酸敏感探針以檢測腸道細菌周質的pH變化[5]．本課題組通過新陳代謝使D-賴氨酸共軛的酸敏感染料進入到大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的肽聚糖中,用于感應免疫吞噬過程中細菌內部pH的變化[6]．雖然效果明顯,但這些方法相對復雜且耗時．對pH敏感的綠色熒光蛋白 (GFP)[7]也被用于細菌內囊泡pH測量,但實際應用時受限于非囊泡區(qū)域熒光團嘈雜的背景[8]．而采用31P化學轉移的核磁共振(NMR)技術[9]檢測細胞pH則需要非常高的細胞濃度,且時間分辨率低,響應時間短,所需設備昂貴[10]．

熒光標記法因其靈敏度高、亮度好、分辨能力高、應用簡便等優(yōu)點而被廣泛應用[11],如細胞內pH熒光探針用于細胞、酶、組織活動等方面的研究[12]．但是用于研究細菌與酸性環(huán)境作用的pH熒光探針并不多[13],而應用最廣的是2,7-二(2-羧基乙基)-5(和6-)-羧基熒光素[14]及其衍生物．不過，該類探針難以定位細菌,易從細胞內泄漏,且其單熒光發(fā)射難以用于pH變化的定量分析[15]．

目前將熒光探針引入細菌內的方式多樣,其中采用顯微鏡下注射[16]、高滲溶菌作用[17]、載體介導的內吞作用[18]等方式引入探針會擾亂細胞靜息狀態(tài)的生理機能[19];而利用二乙酸酯的膜滲透作用將探針(如熒光素二乙酸酯[20])引入細胞內部的方式則存在熒光探針容易泄漏到細胞外的問題.一些研究小組采用電穿孔的方式將帶負電荷的熒光分子(如8-羥基-1,3,6-芘三磺酸[21])引入細胞內來測定其內部pH,但是由于帶負電荷的分子不容易被內部顯負電性的細胞吸收而導致效率低下．因此,如果熒光探針分子能以正電荷的形式利用跨膜電勢驅動進入細菌細胞內,不但可以提高效率,而且避免了上述的一系列問題．

由于羅丹明及其衍生物具有優(yōu)良的物理性能,如較長的可見區(qū)域、較高的熒光量子產率和較大的吸收系數(shù),使其作為熒光標記物得到廣泛應用[11]．細菌結構與哺乳動物細胞的線粒體結構相似[22],具有-180～-140 mV的跨膜負電勢,在電場驅動下陽離子親脂性染料能有效地積聚在線粒體內[23]．因此,帶有正電荷的基于酸敏感羅丹明衍生物的熒光探針,有望用于研究細菌與酸性環(huán)境之間的相互作用．

本研究設計合成了一個包括起內標作用的香豆素結構單元和帶正電荷酸敏感的羅丹明結構單元的電勢差響應陽離子探針(CM-RB),對其進行pH滴定、毒性測試并研究其在酸性環(huán)境下細菌內部的熒光響應．

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

熒光素和香豆素購自Adams試劑公司;2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-羥基苯并三唑、(±)-2,2′-雙-(二苯膦基)-1,1′-聯(lián)萘(BINAP)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自Alfa Aesa試劑公司;4-二甲氨基吡啶購自西亞試劑公司;5-氨基-1-戊醇、三氟甲磺酸酐(Tf2O)、1-叔丁氧羰基哌嗪、三氟乙酸購自Aldrich試劑公司;乙酸鈀和碳酸銫購自百靈威科技公司;吡啶、二氯甲烷、三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、石油醚、甲醇、甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和尼日利亞菌素購自Sigma試劑公司;LB培養(yǎng)基原料購自OXOID公司,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株均購自ATCC公司．除乙腈為色譜純外,其余試劑均為分析純．柱層析硅膠(200～300目)購自于黃?；瘜W試劑公司．實驗所用水均為超純水 (18.2 MΩ·cm)．

酶標儀(Spectra Max M5),低分辨質譜(MS)儀(Bruker Dalton Esquire 3000 plus),NMR儀(Bruker AV 500 MHz),激光共聚焦顯微鏡(Leica SP5),離心機(Beckman Coulter)．

1.2 合成與表征

采用文獻[24]中的方法，用1-叔丁氧羰基哌嗪取代熒光素的羥基合成羅丹明衍生物(化合物1)．7-(二乙基氨基)-N-(5-羥基戊基)香豆素-3-甲酰(CM)參考文獻[25]中的方法，用5-氨基-1-戊醇與香豆素縮合而得(圖1)．

化合物2的合成:稱取600 mg化合物1(0.90 mmol) 于25 mL圓底燒瓶中,在氮氣保護下用10 mL二氯甲烷溶解并將圓底燒瓶置于冰浴中．然后加入0.62 mL三乙胺(4.48 mmol)堿化,再加入511 mL HATU(1.35 mmol)和22 mg 4-二甲氨基吡啶 (0.18 mmol),攪拌2 min后加入465 mg CM (1.35 mmol)．5 min后將圓底燒瓶從冰浴中取出,繼續(xù)在室溫下攪拌過夜．反應后直接將溶劑減壓旋干，過層析柱．先用純乙酸乙酯為洗脫劑除去雜質,再用V(甲醇)∶V(三乙胺)∶V(二氯甲烷)=5∶1∶94為洗脫劑分離出產物,得805 mg紅色固體,產率90%．1H-NMR (500 MHz,CDCl3):δ8.76 (t,J=5.5 Hz,1H),8.64 (s,1H),8.31 (d,J=7.8 Hz,1H),7.81 (t,J=7.4 Hz,1H),7.75 (t,J=7.6 Hz,1H),7.44 (d,J=9.0 Hz,1H),7.32 (d,J=7.2 Hz,1H),7.17 (d,J=9.4 Hz,2H),7.10 (d,J=9.6 Hz,2H),7.05 (s,2H),6.69 (dd,J=8.9,1.6 Hz,1H),6.48 (s,1H),4.01 (t,J=6.2 Hz,2H),3.78 (s,9 H),3.68 (s,9 H),3.48 (q,J=6.9 Hz,4H),3.34～3.30 (m,2H),3.16 (q,J=7.1 Hz,4H),1.48 (s,16H),1.38 (t,J=7.2 Hz,6H),1.25 (dd,J=9.1,5.0 Hz,8H).13C-NMR(126 MHz,CDCl3):δ171.03,164.93,163.07,162.71,160.26,157.96,157.55,156.93,154.36,152.69,147.85,132.98,132.92,131.40,131.12,130.57,130.00,114.96,114.52,110.19,109.65,108.13,97.61,96.27,80.47,65.43,60.28,53.62,46.70,46.31,45.04,39.13,29.02,28.27,28.20,27.90,23.23,20.98,14.14,12.35,8.71.MS (電噴霧模式(ESI)):C57H69N6O10+[M+H+],m/z=997.51(計算值),997.5(測定值).

試劑和條件:a.Tf2O,吡啶;b.BINAP,乙酸鈀,碳酸銫,100 ℃,氮氣;c.1-羥基苯并三唑,EDC,三乙胺;d.HATU,4-二甲氨基吡啶,三乙胺;e.三氟乙酸,二氯甲烷.圖1 熒光探針CM-RB的合成Fig.1 Synthesis of fluorescence probe CM-RB

CM-RB的合成:稱取800 mg化合物2(0.80 mmol)于25 mL圓底燒瓶中,加入10 mLV(三氟乙酸)∶V(二氯甲烷)=1∶4的混合溶液溶解,在室溫下攪拌反應2 h,反應后直接將溶劑減壓旋干，過層析柱．先用V(甲醇)∶V(三乙胺)∶V(二氯甲烷)=5∶1∶94為洗脫劑除去雜質,再用V(甲醇)∶V(三乙胺)∶V(二氯甲烷)=70∶1∶29為洗脫劑分離出產物,得480 mg紅色固體,產率75%．1H-NMR (500 MHz,MeOD):δ8.53 (s,1H),8.32 (d,J=7.8 Hz,1H),7.85 (t,J=7.5 Hz,1H),7.80 (t,J=7.7 Hz,1H),7.47 (dd,J=17.5,8.2 Hz,2H),7.35 (d,J=9.3 Hz,4H),7.29 (d,J=9.2 Hz,2H),6.77 (dd,J=9.0,1.5 Hz,1H),6.48 (s,1H),4.10 (d,J=4.6 Hz,8H),3.97 (dd,J=12.2,6.3 Hz,2H),3.56～3.45 (m,12H),3.26 (t,J=6.9 Hz,2H),1.49～1.40 (m,2H),1.40～1.32 (m,2H),1.22 (t,J=7.0 Hz,6H),1.14～1.06(m,2H).13C-NMR(126 MHz,MeOD):δ165.15,163.72,162.57,161.80,158.41,157.62,157.22,153.13,147.69,132.76,131.51,131.25,131.09,130.53,130.21,130.06,115.39,115.17,110.33,108.68,108.03,98.07,95.83,65.13,44.67,43.83,42.67,38.86,28.55,27.64,22.92,11.40.MS (ESI):C47H53N6O6+[M+H+],m/z=797.40(計算值),797.4(測定值).

1.3 CM-RB的pH滴定

將DMF溶解的CM-RB加到Tris-HCl緩沖溶液(pH分別為4.0,4.5,4.7,4.9,5.1,5.3,5.5,5.7,5.9,6.1,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0)與40%(體積分數(shù))甲醇的混合溶液中，配制成10 μmol/L的CM-RB溶液,每個pH梯度配3個相同的樣品;再分別采用430和540 nm的光激發(fā)CM-RB探針的香豆素和羅丹明結構單元,測定探針的熒光發(fā)射光譜．

1.4 CM-RB的毒性測試

在37 ℃下分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置于LB培養(yǎng)基中生長至600 nm下的光密度(A600)達到0.5左右,離心后用新的LB培養(yǎng)基稀釋到A600為0.25左右．各移取3份細菌液至2.0 mL離心管中,分別添加0,50和100 μmol/L的CM-RB(以不添加CM-RB的為對照組,添加50和100 μmol/L CM-RB的為處理組),振蕩搖勻,繼續(xù)在37 ℃下孵育24 h．分別在0,3,6,9,12和24 h測量并記錄其A600值．

1.5 CM-RB孵育的細菌在不同pH下的熒光響應

在37 ℃下分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置于LB培養(yǎng)基中生長至A600達到0.6,然后用新的LB培養(yǎng)基稀釋至A600為0.3;接著在37 ℃下添加50 μmol/L CM-RB孵育1 h,然后離心,用LB培養(yǎng)基清洗3次;再分別用100 mmol/L pH 4.0～8.0的PBS稀釋,最后用激光共聚焦顯微鏡成像:分別以543和405 nm的光激發(fā)探針,采集羅丹明(550～610 nm)和香豆素(450～510 nm)結構單元的熒光發(fā)射光譜．

1.6 尼日利亞菌素對細菌成像的影響

在37 ℃下分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置于LB培養(yǎng)基中生長至A600達到0.6,再用新的LB培養(yǎng)基稀釋至A600為0.3;接著在37 ℃下添加50 μmol/L CM-RB孵育細菌1 h,然后離心,用新的LB培養(yǎng)基清洗3次;然后將每種細菌分為兩部分,一部分在37 ℃下進一步用1 μmol/L尼日利亞菌素孵育30 min,然后離心,用LB培養(yǎng)基清洗3次，另一部分不進行該處理(作為對照);再分別用100 mmol/L pH 4.0～6.0的PBS稀釋,最后用激光共聚焦顯微鏡成像．

2 結果與討論

2.1 CM-RB的設計與合成

為了利用細菌的跨膜負電勢驅動進入其內部并產生較好的檢測效果,設計了帶正電荷的熒光探針CM-RB,它包含了一個香豆素發(fā)光團和一個連接哌嗪基團的羅丹明作為酸敏感“開關”;基于文獻報道的連接哌嗪基團的羅丹明分子內的pH關聯(lián)光誘導電子轉移(PET)效應[8,26-32](圖2(a)),認為帶正電荷的CM-RB可以在細菌的跨膜負電勢驅動下聚集在細菌內部,并在pH酸化條件下抑制PET效應得到增強紅色熒光,用于細菌與酸性環(huán)境關聯(lián)的分析(圖2(b))．其創(chuàng)新性在于發(fā)展了一種新型的利用正電荷探針靶向活細菌并通過雙色法分析細菌內部酸化過程的方法．如圖1 所示,以熒光素為起始原料,用1-叔丁氧羰基哌嗪取代熒光素的羥基合成羅丹明衍生物(化合物1)，再與CM縮合后脫除叔丁氧羰基(Boc),得到目標探針CM-RB．相關化合物均通過層析柱分離純化(純度98%),所涉及合成步驟產率較高(>75%),產物穩(wěn)定，可長期保存．

(a) 連接哌嗪基團羅丹明的pH關聯(lián)PET效應;(b) 帶正電荷的CM-RB通過細菌跨膜負電勢驅動聚集在細菌內部,酸性條件下通過質子抑制PET效應得到增強的羅丹明熒光.圖2 基于電勢差驅動、酸性激活的熒光探針CM-RB的細菌酸化成像示意圖Fig.2 Schematic diagram of bacterial acidification imaging of fluorescence probe CM-RB based on electric potential difference driving and acid activation

2.2 CM-RB的pH滴定分析

如圖3所示,CM-RB的羅丹明和香豆素結構單元的熒光發(fā)射峰分別在570和470 nm．在pH 8.0～9.0范圍內,羅丹明結構單元的熒光發(fā)射峰強度很弱,在pH 5.5～7.5范圍內其值隨著pH的減小顯著上升(圖3(a)和(c)),這和圖2(a)中描述的質子抑制的PET效應相一致．伴隨著酸性條件下羅丹明結構單元信號的顯著上升,CM-RB中的香豆素結構單元隨著pH的減小則只顯示出輕微的波動(圖3(b)和(c)),這與設計相吻合．如圖3(d)所示,CM-RB的酸敏感反應使得細菌在pH 5.5～7.5范圍內能夠通過改變探針的比率熒光(即570和470 nm的熒光強度比值I570/I470)進行酸化成像．

(a) pH 4.0～9.0范圍內10 μmol/L CM-RB中羅丹明結構單元的熒光發(fā)射譜圖 (λex=540 nm);(b)pH 4.0～9.0范圍內10 μmol/L CM-RB中香豆素結構單元的熒光發(fā)射譜圖(λex=430 nm);(c)CM-RB的pH滴定曲線;(d)依賴于pH值的羅丹明與香豆素結構單元的熒光強度比．圖3 pH關聯(lián)CM-RB的比率熒光Fig.3 pH mediated ratiometric fluorescence of CM-RB

圖4 CM-RB對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)生長的影響Fig.4 Effect of CM-RB on the growth of E. coli (a) and S. aureus(b)

2.3 CM-RB的毒性分析

為了確定CM-RB對細菌的毒性作用,考察了CM-RB對革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌生長的影響,結果如圖4所示:隨著孵育時間的增長,在0～12 h內,對照組與處理組中大腸桿菌的增長速度基本相同;在12～24 h,對照組與處理組中大腸桿菌的生物量均下降,降幅基本一致,說明CM-RB對大腸桿菌的毒性作用較?。瘘S色葡萄球菌在0～9 h內，其對照組與處理組的細菌增長速度基本相同；而在9～24 h,與對照組相比,處理組的增速降低,表明孵育9 h以后CM-RB對金黃色葡萄球菌可能有一定的毒性作用．考慮到實驗時間一般不超過9 h,這些結果顯示在本研究采用的實驗條件下CM-RB的細菌毒性較?。?/p>

2.4 酸性環(huán)境下細菌內部CM-RB的熒光響應

+圖5 在不同pH條件下大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)中CM-RB的熒光響應Fig.5 Fluorescence response of CM-RB in E. coli(a) and S. aureus(b)under different pH conditions

圖5所示為不同pH條件下大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中CM-RB的熒光響應,可以看出,在激光共聚焦熒光顯微鏡中能觀察到不同pH下細菌內部較強的香豆素結構單元的藍色熒光,表明CM-RB有效聚集在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌內部;與香豆素信號相比,羅丹明結構單元的熒光強度隨著pH減小逐漸增強．這些結果表明CM-RB能夠被活細菌吸收，并且在酸性環(huán)境下細菌內部能夠顯示出雙重熒光,可用于雙色法分析細菌內部的酸化過程．

2.5 酸性環(huán)境下膜通透細菌內部CM-RB的熒光響應

尼日利亞菌素是一種質子載體,它能夠破壞細菌膜電位并穿過細菌膜,使得細菌內部和外部環(huán)境酸性相同．為了檢測在膜電位降低情況下CM-RB是否還留在細菌內,以及細菌膜通透對細菌內部pH變化的影響,用尼日利亞菌素處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌．如圖6所示：在不同酸性pH條件下,用尼日利亞菌素處理過的兩種細菌內羅丹明結構單元的紅色熒光都比對照組的熒光亮度更高,顏色更深；而且清洗之后紅色熒光仍然在細菌內部,亮度并未減弱,洗液中也沒有發(fā)現(xiàn)熒光探針溢出．這些結果表明膜通透后CM-RB熒光探針錨定在細菌細胞內并產生了強烈的酸響應,也間接說明探針進入細菌并非通過膜滲透而是通過電勢驅動進入,且該探針能夠利用PET效應起到增強熒光的效果．

+表示尼日利亞菌素處理組;-表示對照組.圖6 細菌膜通透情況下大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)中CM-RB在不同pH條件下的熒光響應Fig.6 The fluorescence response of CM-RB in E. coli (a) and S. aureus (b) under different pH conditions when the bacterial cell membrane is permeable

由于細菌進化了不同的方法來抵消外部酸性環(huán)境的負面影響．如圖6所示,膜的低通透性也是細菌抵消外部極端酸性的一種有效方法．因此,增加細菌膜的通透性將有助于提高酸性介質的滅菌效率．這對于日常生活中進行滅菌消毒、預防細菌感染等方面具有重要的啟示作用．

3 結 論

細菌和酸性環(huán)境之間的相互作用是微生物學研究的一個重要領域．含有內標信號香豆素和酸敏感的羅丹明衍生物組成的電勢差響應陽離子探針CM-RB能夠有效聚集在細菌內部,并對pH變化產生敏感的比率熒光信號(堿性條件下顯藍色熒光,酸性條件下紅色熒光增強)．另外,CM-RB具有亮度高、背景信號少和在水中溶解性好的特點,使其適合分析細菌內部pH變化．本研究提供了一個分析細菌與酸性環(huán)境相互作用的簡單有效的方法,該方法在研究殺菌劑等方面具有潛在用途．