喻曉路

徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目最多的一種細(xì)胞,它作為膠質(zhì)細(xì)胞的主要類別,幾乎囊括了膠質(zhì)細(xì)胞的所有功能[1]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被公認(rèn)為是AS的標(biāo)志性蛋白，在感染、創(chuàng)傷、神經(jīng)退行性疾病等病理條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活對防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病有重要意義[2]。BDNF(brain derived neu rotropic factor,腦源性神經(jīng)生長因子)是一種重要的神經(jīng)因子，在生理環(huán)境下具有促進(jìn)突觸的形成、維持神經(jīng)系統(tǒng)的功能[3-6]。mPFC腦區(qū)是一個腦內(nèi)與運(yùn)動、學(xué)習(xí)記憶、情緒等功能關(guān)系密切的重要腦區(qū)，其中就包括神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[7]。腦組織的缺糖缺氧是腦缺血患者的主要癥狀之一，其中腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞會大量增生，是一種缺血后的全腦保護(hù)性防御機(jī)制[8]。該次對比了腦片培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，認(rèn)為腦片培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比更多的保留了細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，能夠更好的模擬生理狀態(tài)，并且操作更簡便，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求也不高[9-10]。該實(shí)驗(yàn)采用腦片培養(yǎng)的方法，目前此方法已經(jīng)成熟，見圖1，圖中神經(jīng)元形態(tài)清晰。該實(shí)驗(yàn)在2017年12月—2018年2月期間在徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室將18只小鼠隨機(jī)分為3組，對小鼠mPFC腦區(qū)的腦片進(jìn)行缺糖缺氧處理和復(fù)灌，并與加入BDNF的處理組進(jìn)行比較，對GFAP蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測定，明確BDNF在缺糖缺氧條件下小鼠mPFC腦區(qū)的作用，為腦缺血病患所進(jìn)行溶栓治療的方法提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 腦片培養(yǎng)mPFC腦區(qū)HE染色20X

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級昆明小鼠18只，體重25～30 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。

1.2 儀器和試劑

材料：BDNF（2837）購自 TOCRIS 公司，RIPA 裂解液（KGP702-100）購自凱基生物公司，低糖DMEM培養(yǎng)基（ABB210359）和 EBSS 培養(yǎng)基（AB10134597）均購自 Hy-Clone公司，青鏈霉素混合液（VC2003）購自VICMED公司，GFAP （12389）一抗購自 Cell Signaling Technology公司，GAPDH（10494）一抗購自 proteintech公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（A0208）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009）購自碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL發(fā)光試劑盒 （AC36131）購自bioworld公司，Transwell 24孔板細(xì)胞培養(yǎng)小室（3413）購自Corning公司，PVDF膜（IPVH00010）購自Immobilon公司，自動震動切片機(jī)購自萊卡公司，化學(xué)發(fā)光儀購自BIO-RAD公司，其余自配液體試劑均購自sigma公司。

自配溶液：高滲糖溶液Sucrose 254 mM,D-Glucose 10 mM,NaH2PO41.25 mM,NaHCO324 mM,MgSO4·7H2O 2 mM,KCl 3 mM,CaCl2·2H2O 2 mM，用去離子水溶解。使用前通入95%O2+5%CO230 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腦片制備 實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)七氟烷誘導(dǎo)麻醉后，迅速斷頭，然后用剪刀剪開兩耳間的皮膚直至兩鼻間，然后翻轉(zhuǎn)皮膚，暴露顱骨。用眼科剪去掉小鼠顱骨，暴露全腦。隨后用眼科鑷伸入腦前端下部的嗅球處，輕輕挑起腦的前端，剪斷腦神經(jīng)，翻轉(zhuǎn)全腦，放入冰冷、預(yù)先通95%O2+5%CO2混合氣 30 min的高滲糖溶液中，放置1～2 min。取出全腦，除去小腦和嗅球，用刀片切取鼠腦前中部，迅速用502膠水將腦組織塊底部粘在自動震動切片機(jī)的緩沖槽中，用高滲糖溶液浸沒組織塊，設(shè)置自動震動切片機(jī)的切片速度、厚度和距離，切取含有mPFC腦區(qū)的厚度為300 μm的腦片，大約可以取3～5片，用小刀切去多余組織，只保留mPFC區(qū)域，整個過程在8 min內(nèi)完成，高滲糖溶液溫度維持在4℃。24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)加0.5 mL的腦片培養(yǎng)液，即低糖DMEM培養(yǎng)基，其中包括1%青鏈霉素混合液，將取好的腦片移入Transwell的小室中，盡量完全吸棄高滲糖溶液，將小室放入培養(yǎng)板中，使培養(yǎng)基的液面剛好達(dá)到腦片的水平，但不漫過腦片，將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中的自制密閉容器中，自制密閉容器有輸入和輸出氣體的導(dǎo)管。腦片培養(yǎng)基的組成：低糖DMEM+1%的青鏈霉素混合液。腦片的培養(yǎng)條件為：溫度37℃，持續(xù)穩(wěn)定通入95%O2+5%CO2混合氣體，微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。要保證腦片的上表面充分暴露于氣體環(huán)境中。

1.3.2 充N2法制備腦片缺氧缺糖模型 將缺氧缺糖組的腦片更換為EBSS培養(yǎng)基，并移進(jìn)充入5%CO2+95%N2混合氣體的密閉容器中，在37℃培養(yǎng)箱中是以0.5 L/min的流量充入混合氣，于15 min后換成低糖培養(yǎng)基并復(fù)氧，通入95%O2+5%CO2混合氣體，在37℃培養(yǎng)箱中復(fù)灌培養(yǎng) 1 h。

1.3.3 分組 正常組：選取正常昆明小鼠6只，取mPFC腦區(qū)，采用低糖DMEM培養(yǎng)基并通入95%O2+5%CO2混合氣體進(jìn)行培養(yǎng)。

缺糖缺氧復(fù)灌組（OGD/R）：選取正常昆明小鼠6只，取mPFC腦區(qū)，采用EBSS培養(yǎng)基并通入5%CO2+95%N2混合氣體進(jìn)行培養(yǎng)15 min，并進(jìn)行復(fù)灌，即將帶有腦片的小室置入加入DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體1 h。

缺糖缺氧復(fù)灌給藥組（OGD/R+BDNF）：選取正常昆明小鼠6只，取mPFC腦區(qū)，采用在EBSS培養(yǎng)基中加入BDNF（BDNF 用量為 50 ng/μL）并通入 5%CO2+95%N2混合氣體進(jìn)行培養(yǎng)15 min，并進(jìn)行復(fù)灌，即將帶有腦片的小室置入加入DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體1 h。

1.3.4 對檢測樣品的制備和免疫印跡分析 在模型制作完成后，將腦片移入潔凈的EP管中，加入蛋白裂解液，用電動勻漿器將組織打碎，充分裂解組織，4℃10 000轉(zhuǎn)離心30 min，棄去沉淀，將上清液移入新EP管中，并做好標(biāo)記。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，測定蛋白濃度，將樣品配平，按照每孔20 ng的蛋白量進(jìn)行上樣跑電泳，采用半干轉(zhuǎn)的方式將膠中的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉 1 h，移入 GFAP（1∶1 000）一抗和 GAPDH（1∶5 000）一抗中4℃過夜，室溫復(fù)溫30 min,washing buffer清洗3次，5 min/次，轉(zhuǎn)入HPR標(biāo)記的兔二抗中孵育40 min，washing buffer清洗3次，15 min/次。用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光記錄。用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析，（one-way ANOVE）進(jìn)行組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常組GFAP蛋白的相對表達(dá)量為 （1.066 33±0.356 753），缺糖缺氧復(fù)灌組GFAP蛋白的相對表達(dá)量為（2.317 57±0.578 685），缺糖缺氧復(fù)灌給藥組GFAP蛋白的相對表達(dá)量為（1.377 63±0.0619 96）。通過對正常組、缺糖缺氧復(fù)灌組和缺糖缺氧復(fù)灌給藥組的小鼠mPFC腦區(qū)的GFAP蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較，通過蛋白免疫印跡的檢測結(jié)果顯示，缺糖缺氧復(fù)灌組與正常組相比GFAP蛋白的相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），缺糖缺氧復(fù)灌給藥組與缺糖缺氧復(fù)灌組相比GFAP的蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。缺糖缺氧復(fù)灌給藥組與正常組相比GFAP的蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。 見圖 2。

圖2 GFAP表達(dá)水平比較

3 討論

腦部缺糖缺氧是腦缺血病患的主要癥狀，它可以導(dǎo)致人類殘疾或者死亡，眾多的研究表明腦組織的缺糖缺氧會誘發(fā)一系列的病理變化，甚至短暫性的缺糖缺氧也會對腦組織造成一定的損傷[8]。腦組織主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是神經(jīng)元的10～50倍，其中大部分為星形膠質(zhì)細(xì)胞[1-2]。有報道稱BDNF具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)的作用，可以幫助神經(jīng)損傷后傳導(dǎo)功能的恢復(fù)。缺糖缺氧對腦組織的損傷尤其表現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞的大量增生上。mPFC腦區(qū)與運(yùn)動、學(xué)習(xí)記憶等功能關(guān)系密切，此腦區(qū)的損傷會影響多個生理功能[7]。在缺糖缺氧的條件下加入BDNF，能有效減緩GFAP蛋白表達(dá)量的升高。正常組GFAP蛋白的相對表達(dá)量為（1.066 33±0.356 753），缺糖缺氧復(fù)灌組GFAP蛋白的相對表達(dá)量為（2.317 57±0.578 685），缺糖缺氧復(fù)灌給藥組GFAP蛋白的相對表達(dá)量為（1.377 63±0.0619 96）。缺糖缺氧復(fù)灌組與正常組相比GFAP蛋白的相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），缺糖缺氧復(fù)灌給藥組與缺糖缺氧復(fù)灌組相比GFAP的蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。缺糖缺氧復(fù)灌給藥組與正常組相比GFAP的蛋白相對表達(dá)量升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用建立mPFC腦區(qū)腦片缺糖缺氧的模型，很好的模仿了短暫性腦缺血的癥狀，同時加入BDNF的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了BDNF在短暫性缺糖缺氧對mPFC腦區(qū)GFAP蛋白的作用，以此說明BDNF可以有效降低GFAP蛋白的表達(dá)量，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎性因子的釋放，從而減少神經(jīng)元的損傷[11]。

現(xiàn)有報道顯示BDNF作為一種重要的腦源性神經(jīng)生長因子對于腦內(nèi)神經(jīng)元都起到很好的保護(hù)和營養(yǎng)作用，其中也包括mPFC腦區(qū)，在慢性病理性疼痛下大鼠的mPFC內(nèi)的BDNF表達(dá)量升高[12]。而對GFAP蛋白在mPFC的研究僅限于抑郁癥等精神類疾病的研究上，文獻(xiàn)報道中提到的腦卒中后抑郁癥條件下BDNF和GFAP均有影響[13-14]。對于由于腦缺血所造成的缺糖缺氧癥狀而引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，從而造成神經(jīng)元的損傷方面卻沒有研究，該研究正好填補(bǔ)了這一空白。

綜上所述，BDNF在小鼠mPFC腦區(qū)缺糖缺氧條件下，GFAP蛋白的表達(dá)量比未使用BDNF的蛋白表達(dá)量降低，說明BDNF可以有效降低星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP蛋白的表達(dá)，從而說明可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增多，從而降低炎性因子對神經(jīng)元的損傷，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，以上實(shí)驗(yàn)給BDNF的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，若對BDNF的作用機(jī)制和作用效果進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，將會改善由于腦缺血造成的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法。此研究的應(yīng)用前景非常廣闊。