韋應(yīng)莉，曹文俠，*，李建宏，張愛梅，李小龍

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，蘭州 730070 2 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070

土壤微生物是微生物界的重要成員，對土壤肥力的形成和轉(zhuǎn)化起著積極作用。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)能量流動與物質(zhì)循環(huán)的重要角色，受土壤環(huán)境和地上生物量的影響，對預(yù)測土壤有機質(zhì)乃至土壤環(huán)境的變化過程敏感[1]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的改變，可以進一步反映外界環(huán)境的變化，對于土壤生態(tài)環(huán)境的動態(tài)監(jiān)測具有重要的指示作用[2- 5]。由于土壤微生物的數(shù)量巨大，組成極為復(fù)雜，用傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法往往會低估土壤微生物真實狀況，給準(zhǔn)確了解微生物群落結(jié)構(gòu)帶來困難[6]。磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids，PLFA)是活體微生物細(xì)胞膜恒定組分，它對環(huán)境因素比較敏感、能在生物體外迅速降解，因此特定菌群PLFA數(shù)量改變可反映原位土壤真菌、細(xì)菌活體生物量與菌群結(jié)構(gòu)[7]。磷脂脂肪酸(PLFA)法具有對試驗條件要求低、測試功能多和穩(wěn)定性好等優(yōu)點[8]，被廣泛應(yīng)用于微生物動態(tài)檢測中。王曙光等[9]主要對磷脂脂肪酸(PLFA)方法在土壤微生物分析中的應(yīng)用做一剖析。顏慧等[10]將常用的研究微生物多樣性的幾種方法進行了比較，通過一些實例證明PLFA方法的特色或獨到之處。

放牧是人類利用草地資源的主要方式，而不合理的放牧將使草地植被退化，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分循環(huán)惡化[11- 12]。另外，不同強度放牧不僅對土壤微生物各類群數(shù)量產(chǎn)生影響，還影響微生物類群的組成[13]。圍封作為退化草地生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的重要手段，其對土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化的影響逐漸成為近年來研究的熱點之一。李春莉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，適度的放牧使壤微生物數(shù)量增加，而不放牧和過度放牧不利于土壤微生物的生長。張成霞和南志標(biāo)[15]對不同放牧強度下隴東天然草地土壤微生物三大類群的動態(tài)特征研究表明，圍欄封育和適度放牧均有助于土壤微生物的恢復(fù)，使草地土壤微生物的數(shù)量增加，但過度放牧降低了土壤微生物的活性，導(dǎo)致微生物數(shù)量下降。祁連山作為青藏高原和北部內(nèi)陸荒漠地區(qū)重要的分水嶺，地處青藏、蒙新、黃土三大高原交匯地帶，形成了獨具特色的生物多樣性和成土條件[16]。高寒杜鵑灌叢草地作為東祁連山主要地帶性植被之一，其生態(tài)系統(tǒng)脆弱，退化程度日益加重，且恢復(fù)周期長[17]。放牧對高寒灌叢草地產(chǎn)生的影響如何，過度放牧后的圍封恢復(fù)在土壤微生物方面有何響應(yīng)并不清楚。本研究以高寒杜鵑灌叢草地為研究對象，旨在探討不同強度放牧和圍封對高寒灌叢草地土壤微生物群落及其結(jié)構(gòu)特征的影響，從而揭示了微生物對灌叢草地圍封和放牧后的變化規(guī)律和響應(yīng)，為祁連山高寒杜鵑灌叢草地的合理利用提供有效措施和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)自然概況

試驗地選在青藏髙原東部的天祝縣金強河地區(qū)(37°11′ N，102°47′ E)，平均海拔3200 m，年均溫-0.1℃，最冷月(1月)平均氣溫為-18.3℃，最熱月(7月)平均氣溫為12.7℃；≥0℃和≥10℃的年積溫分別為1581℃和1026℃；年降水量416 mm，多為地形雨(其中66%集中在7—9月)；年蒸發(fā)量1592 mm。無絕對無霜期，每年5月下旬植被進入返青期，10月上旬枯黃，生長季長120—l40 d。土壤為高山灌叢草甸土，顯微堿性，土層較薄，為40—80 cm。植被分布受地形特征和氣候差異等因素的影響，垂直分異明顯，沿海拔梯度向上依次分布著珠芽蓼草甸、金露梅灌叢、杜鵑灌叢等。試驗設(shè)在杜鵑灌叢草地，坡向西北。灌下生長著以問荊(Equisetumarvense)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、嵩草(Kobresiaspp.)、苔草(Carexspp.)等為優(yōu)勢種的草層植物。

1.2 樣地設(shè)置與樣品采集

2014年6月，選取坡向和海拔一致圍欄高寒杜鵑灌叢草地作為研究樣地，以相鄰禁牧杜鵑灌叢為未放牧利用的參照草地，根據(jù)農(nóng)業(yè)部放牧利用草地退化分級標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮灌下可飼用草本植物利用率、可飼用灌木被采食率，灌叢地境土壤基況及家畜踐踏程度[18]，將樣地劃分為：重度放牧(HG)、中度放牧(MG)、輕度放牧(LG)。分別在不同放牧強度灌叢草地內(nèi)沿海拔方向各設(shè)置3個100 m×30 m的圍欄，共9個圍欄，實施全年禁牧，作為恢復(fù)樣地，繼續(xù)觀測，以圍欄外的自由放牧圍封灌叢草地為對照，放牧家畜為藏羊、牦牛。

土壤樣品于2016年8月中旬采集，鑒于圍封時間較短，而且草地土壤中微生物數(shù)量的垂直分布一般是上層大于下層[19]，本試驗取0—10 cm土壤，按照S型曲線選擇40個點，去除表面植被，用直徑為3.5 cm的土鉆取樣，最后將40份土樣混勻過篩，去除根系和土壤入侵物，采用“四分法”選取1 kg土樣冷藏帶回實驗室保存于-70 ℃超低溫冰箱，用于測定土壤微生物PLFA分析；一份帶回實驗室風(fēng)干，用于測定土壤有機質(zhì)和全氮。

1.3 測定方法

1.3.1 PLFA的測定

土壤中脂肪酸的提取和檢測主要分為4步：提取、分離、酯化、GC-MS分析[1- 2]。

主要試劑：37種脂肪酸混標(biāo)(FAME)(Supelco，USA)和26種脂肪酸混標(biāo)(BAME)(Supelco，USA)。

1.3.2 土壤有機質(zhì)和全氮分別采用重鉻酸鉀-外加熱法和半微量凱氏法。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

脂肪酸采用Frosteg?rd方法命名[20]。PLFA可以作為微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)變化的生物標(biāo)記分子[20-21]。根據(jù)已有的研究結(jié)果，指示特定微生物的PLFA生物標(biāo)記物如下表(表1)。微生物生物量用各PLFA含量加和表示[25]，另外，常用一些相關(guān)生理比值來分析磷脂脂肪酸(PLFA)數(shù)據(jù)，如(cyc17:0+cyc19:0)/(16:1ω7c+18:1ω7c)表示壓力指數(shù)[26]、細(xì)菌/真菌、革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌(G+/G-)。用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析、差異顯著性比較(α=0.05)、主成分分析和相關(guān)性分析；采用Excel作圖。

表1 不同微生物種群的磷脂脂肪酸標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2.1 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤有機碳、全氮含量的影響

方差分析結(jié)果表明(表2)，高寒杜鵑灌叢草地土壤有機碳和全氮含量隨著放牧強度的增強而降低，且差異顯著(P<0.05)。LG灌叢草地土壤有機碳含量比MG高44.0%左右，全氮含量比MG高25.0%左右；MG灌叢草地土壤有機碳比HG高38.0%左右，全氮含量比HG高22%左右。各個放牧強度下圍封處理后的土壤有機碳和全氮含量略高于放牧處理，但均未達(dá)到顯著水平。

表2 不同放牧強度下土壤有機碳、全氮含量/(g/kg)

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤磷脂脂肪酸數(shù)量的影響

如圖1，各個樣地均檢測出18種脂肪酸(14:0，i15:0，a15:0，15:0，16:0，i16:0，i17:0，16:1ω7c，cy17:0，17:0，10Me16:0，10Me18:0，18:2ω6，18:1ω9c，18:1ω9t，18:0，cy19:0，20:0)，其中都以16:0和10Me16:0的含量最高，i15:0，16:1ω7c，10Me16:0，16:0和18:1ω9c的總和占脂肪酸總量的64%—68%。由表3可知，構(gòu)成脂肪酸的主要是6種支鏈飽和脂肪酸(BFA)，絕對含量占總量的42.25%—47.10%，其中主要是i15:0和10Me16:0；其次是6種直鏈飽和脂肪酸(SFA)，絕對含量占總量的23.18%—27.81%，其中主要是16:0和18:0；3種直鏈單不飽和脂肪酸(MFA)，絕對含量占總量的21.18%—22.23%，其中主要是16:1ω7c和18:1ω9c；多不飽和脂肪酸(PFA)1種，絕對含量占總量的1.44%—2.12%；環(huán)丙烷脂肪酸2種，絕對含量占總量的4.61%—6.22%。

表3 不同樣地土壤磷酸脂肪酸類型及其比例/%

由圖1可知，脂肪酸14:0、15:0、16:0、17:0、18:0、18:2ω6,9、18:1ω9c、18:1ω9t、10Me16:0和10Me18:0的含量隨著放牧強度的增強而降低，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)。圍封處理下，i15:0、i16:0、i17:0含量在HG和MG間無顯著差異，但顯著高于LG灌叢草地；16:1ω7c(好氧細(xì)菌)含量在MG出現(xiàn)峰值，且差異顯著(P<0.05)，在LG和HG間無顯著差異；(厭氧細(xì)菌)cy17:0和cy19:0的含量在各個放牧強度間存在顯著差異(P<0.05)，且cy17:0隨著放牧強度的增強而升高；a15:0和20:0的含量在各個放牧強度間無顯著差異；放牧處理下，脂肪酸i15:0、a15:0、、i16:0、i17:0、cy17:0和cy19:0的含量在各個放牧強度下隨著放牧強度的增大而降低，且差異顯著(P<0.05)；16:1ω7c含量在MG灌叢草地出現(xiàn)最低值，且顯著低于LG灌叢草地(P<0.05)，但與HG差異不顯著；20:0的含量在各個放牧強度間均無顯著差異。HG強度下，圍封處理后的18:0和20:0含量低于放牧處理，但差異不顯著，而其他脂肪酸的含量都高于放牧處理，且都達(dá)到顯著水平(P<0.05)；MG強度下，圍封處理后的14:0、15:0、16:1ω7c，、i15:0、i16:0、i17、10Me16:0、cy17:0和cy19:0的含量都高于放牧處理，16:0、17:0、10Me18:0、18:1ω9c、18:1ω9t 、18:2ω6,9和18:0的含量都低于放牧處理；LG強度下，圍封處理后的18:1ω9c的含量高于放牧處理，且差異顯著(P<0.05)，而其他脂肪酸的含量與放牧處理無顯著差異。

2.3 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

磷脂脂肪酸的組成可以反映土壤微生物群落的細(xì)微變化，如生物量和分類結(jié)構(gòu)的改變[27]。土壤微生物的生物量可通過直接從土壤中提取的磷酯脂肪酸的量來準(zhǔn)確地表達(dá)。

2.3.1 不同強度放牧和圍封對度高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物PLFA總量的影響

由圖2可以看出，方差分析表明，土壤微生物PLFA總量隨著放牧強度的增強而降低，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)。圍封處理下，LG灌叢草地土壤微生物PLFA總量分別比MG和HG高4.1%和13.8%，MG比HG高9.2%；放牧處理下，LG土壤微生物PLFA總量分別比MG和HG高12.4%和37.3%，MG比HG高22.2%。HG和MG強度下，圍封處理后的灌叢草地土壤微生物總量分別比放牧處理高8.1%和20.9%，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)；LG強度下，圍封處理后的灌叢草地土壤微生物PLFA總量略高于放牧處理，但未達(dá)到顯著水平。說明隨著放牧強度的增大，土壤微生物的生物總量不斷減少，各個放牧強度下圍封處理后的微生物的生物總量都高于放牧處理，但在HG強度下圍封處理對微生物總生物的提高作用比較明顯。

2.3.2 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地細(xì)菌生物量的影響

如圖2，土壤細(xì)菌生物量隨著放牧強度的增強而降低，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)。圍封處理下，LG灌叢草地土壤細(xì)菌生物量分別比MG和HG高1.2%和6.1%，MG比HG高4.9%，在LG、MG和HG強度下，細(xì)菌生物量占微生物總量的百分?jǐn)?shù)分別為59.7%、61.4%和64.0%；放牧處理下，LG土壤細(xì)菌生物量分別比MG和HG高15.3%和29.9%，MG比HG高12.7%，在LG、MG和HG強度下，細(xì)菌生物量占微生物總量分的百分?jǐn)?shù)別為59.5%、58.0%和62.9%。HG和MG強度下，圍封處理后的土壤細(xì)菌生物量分別比放牧處理高23.1%和14.6%，且差異顯著(P<0.05)；LG強度下，圍封處理后的土壤細(xì)菌生物量略高于放牧處理，但差異不顯著?？梢钥闯?，圍封處理和放牧處理在不同放牧強度下土壤微生物細(xì)菌的生物量變化與微生物總生物量變化大致相同，這也證明了土壤微生物是以細(xì)菌為主體的群落結(jié)構(gòu)。

圖2 不同樣地土壤微生物各菌群生物量Fig.2 PLFA of each group of soil microorganisms in different sample sites相同字母表示差異不顯著(P>0.5)

2.3.3 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤真菌生物量的影響

見圖2，土壤真菌生物量隨著放牧強度的增強而降低，且差異顯著(P<0.05)。圍封處理下，LG灌叢草地土壤細(xì)菌生物量分別比MG和HG高14.0%和17.5%，MG比HG高12.1%；放牧處理下，LG土壤細(xì)菌生物量分別比MG和HG高10.5%和57.4%，MG比HG高42.4%。HG強度下，圍封處理后的土壤真菌生物量比放牧處理高32.2%，且差異顯著(P<0.05)；MG強度下，圍封處理后的土壤真菌生物量顯著比放牧處理低4.3%，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)；LG強度下，圍封處理后的土壤真菌生物量略高于放牧處理，但未達(dá)到顯著水平。可以看出，圍封處理在LG和MG強度下使土壤真菌生物量降低，而在HG強度下又使土壤真菌生物量顯著增加，總的來看，不管是放牧處理還是圍封處理，土壤真菌生物量都隨著放牧強度的增大而降低，且各個放牧強度下圍封處理對土壤真菌生物量影響作用各不相同。

2.3.4 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤放線菌生物量的影響

圖2，土壤放線菌生物量隨著放牧強度的增強而降低，且差異顯著(P<0.05)。圍封處理下，LG土壤放線菌生物量分別比MG和HG高5.7%和34.7%，MG比HG高27.4%；放牧處理下，LG土壤放線菌生物量分別比MG和HG高7.0和45.2%，MG比HG高35.7%。HG強度下，圍封處理后的土壤放線菌生物量比放牧處理高8.1%，且差異顯著(P<0.05)；LG和MG強度下，圍封處理后的土壤放線菌生物量略高于放牧處理，但未達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明，土壤放線菌生物量都隨著放牧強度的增大而降低；圍封處理能使灌叢草地土壤放線菌生物量增加。

2.3.5不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤G+/G-的影響

由圖3可知，圍封處理下，土壤革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的PLFA含量比值(G+/G-)在各個放牧強度間差異不顯著；放牧處理下，G+/G-隨著放牧強度的增強而降低，且在LG和MG強度間差異不顯著，但顯著高于HG強度。在HG強度下，圍封處理后的G+/G-比放牧處理高32.2%，且差異顯著(P<0.05)；MG和LG強度下，圍封處理后的G+/G-略高于放牧處理，但均未達(dá)到顯著水平。各個強度放牧和圍封的灌叢草地土壤中革蘭氏陽性菌含量均高于革蘭氏陰性菌含量，而HG圍封處理后的灌叢草地G+/G-顯著高于放牧處理，主要是由圍封處理后的土壤中革蘭氏陽性菌含量明顯升高造成的。圍封處理后的土壤G+/G-在各個放牧強度間較接近，不存在顯著性差異，這說明圍封處理可以維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖3 不同樣地土壤微生物各菌群生物量比值Fig.3 Ratios of each group of soil microorganisms in different sample sites各個菌群比值的相同字母表示差異不顯著(P>0.5)

2.3.6 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤細(xì)菌/真菌生物量比值的影響

一般認(rèn)為細(xì)菌/真菌比值可判斷土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和兩個種群的相對豐富程度[28]。由圖3可看出，圍封處理下，細(xì)菌/真菌比值開始隨著放牧強度的增強而升高，后趨于平穩(wěn)；放牧處理下，細(xì)菌/真菌比值在各個放牧強度間差異顯著(P<0.05)，在HG強度下最高，在MG強度下最低。HG強度下，圍封處理后的細(xì)菌/真菌比值比放牧處理低6.9%，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)；MG強度下，圍封處理后的細(xì)菌/真菌比值比放牧處理高19.8%，且差異顯著(P<0.05)；LG強度下，圍封處理后的細(xì)菌/真菌比值略高于放牧處理，但未達(dá)到顯著水平。說明不同強度放牧和圍封對土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性及兩個種群的相對豐富程度及有一定的影響。

2.3.7 不同強度放牧和圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物壓力指數(shù)的影響

圖4 不同樣地PLFA主成分分析 Fig.4 Principal component analysis of PLFAs of different sample sitesX1：14:0；X2：i15:0；X3：a15:0；X4：15:0；X5：i16:0；X6：16:1ω7c；X7：16:0；X8：i17:0；X9：cy17:0；X10：17:0；X11：10Me16:0；X12：10Me18:0；X13：18:2ω6,9；X14：18:1ω9t；X15：18:1ω9c；X16：18:0；X17：cy 19:0；X18：20:0

微生物壓力指數(shù)(cyc17:0+cyc19:0)/(16:1ω7c+18:1ω7c)作為評價土壤微生物群落對環(huán)境適應(yīng)程度的具體指標(biāo)。由圖3看出，圍封處理下，微生物壓力指數(shù)隨著放牧強度增強開始無顯著差異而后又升高，且差異顯著(P<0.05)；放牧處理下，微生物壓力指數(shù)隨著放牧強度增強開始無顯著差異而后又降低，且差異顯著(P<0.05)。HG強度下，圍封處理后的壓力指數(shù)顯著比放牧處理高26.0%，且差異顯著；MG強度下，圍封處理后的壓力指數(shù)比放牧處理低4.5%，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)；LG強度下，圍封處理后的微生物壓力指數(shù)比放牧處理略高1.3%，但未達(dá)到顯著水平。

2.4 總PLFA主成分分析

供試土壤的18種脂肪酸進行主成分分析，PC1、PC2和PC3三個主成分合計達(dá)到土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的92.61%，其余7.39%為其他種群微生物。PC1和PC2總的方差貢獻(xiàn)率為85.62%，因此PC1和PC2基本可以全面反映研究區(qū)域微生物群落結(jié)構(gòu)特征，18種脂肪酸可以分成兩個主要類型(圖4)。其中中PC1主要由直鏈飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、直鏈單不飽和脂肪酸、支鏈飽和脂肪酸環(huán)丙烷脂肪酸組成，占微生物群落結(jié)構(gòu)變異的50.94%；其中14:0、15:0、10Me16:0和18:1ω9c的含量較高，占第一主成分的53.68%。PC2包括直鏈飽和脂肪酸、直鏈單不飽和脂肪酸、環(huán)丙烷脂肪酸和支鏈飽和脂肪酸，解釋微生物群落結(jié)構(gòu)組成變異的30.68%，主要由i16:0、16:1ω7c、i17:0、cy17:0、17:0、18:1ω9t、18:0和cy19:0脂肪酸組成，占第二主成分的51.34%。由特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘得出主成分表達(dá)式及公式：F=54.94%·FPC1+30.68%·FPC2+0.0699·FPC3，計算不同強度放牧和圍封的總和得分F值(土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響程度指數(shù))，并進行排序得到MG圍封>HG圍封>LG圍封>LG放牧>MG放牧>HG放牧，即放牧和圍封處理對高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度是圍封處理大于放牧處理。由此可知，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響程度指數(shù)的排序結(jié)果與前面的論證結(jié)果一致，故主成分分析結(jié)果能較好地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖5 樣地間脂肪酸主成分分析 Fig.5 Principalcomponent analysis of PLFA structure among sites

不同強度放牧和圍封地土壤磷脂脂肪酸的主成分分析(圖5)，結(jié)果表明各處理與第一主成分表現(xiàn)出正相關(guān)，HG圍封、HG放牧和MG圍封與第二主成分表示出正相關(guān)，其他處理與第二主成分表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。6種處理樣地相距較近，且MG放牧、LG放牧和LG圍封土壤的因子載荷十分接近，三者幾乎重疊，但部分處理樣地明顯分開。說明不同強度放牧和圍封改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.5 各菌群PLFA與土壤有機碳、全氮的相關(guān)性分析

本試驗對不同放牧強度杜鵑灌叢草地各菌群PLFA與土壤有機碳、全氮進行相關(guān)性分析表明(表4)，土壤總PLFA量、細(xì)菌、真菌和放線菌的PLFA與土壤有機碳、全氮均呈極顯著正相關(guān)，細(xì)菌/真菌比值與有機碳、全氮呈極顯著負(fù)相關(guān)?？捎闷鋪肀碚魍寥肋@兩項重要的肥力屬性，也說明它們可用作評價土壤肥力與健康的生物指標(biāo)，同時在這一地區(qū)土壤碳、氮含量也是影響土壤微生物數(shù)量和種類的最重要養(yǎng)分因素。

表4 微生物種群與土壤有機碳、全氮相關(guān)性分析

** 兩尾檢驗，P<0.01

3 討論

土壤微生物群落多樣性可以檢測系統(tǒng)受干擾后的細(xì)微變化，描述微生物群落變化和自然或人為干擾對群落的影響。高寒杜鵑灌叢草地土壤真菌生物量最少，占微生物總量的14.00%—16.32%，細(xì)菌生物量占微生物總量的57.97%—63.98%，放線菌生物量占微生物總量的20.47%—24.49%。以往的研究表明，在pH值較高的堿性土壤中細(xì)菌占據(jù)優(yōu)勢地位，反之則真菌占據(jù)優(yōu)勢地位[29]。姚拓和龍瑞軍[30]采用平板表面涂抹法和稀釋法對天祝高寒草地不同干擾生境土壤三大類微生物數(shù)量的時空動態(tài)進行了測定，結(jié)果表明三大類微生物中，細(xì)菌數(shù)量最大，放線菌次之，真菌最小，分別占微生物總數(shù)的82.29%—86.09%，13.91%—17.71%和0.017%—0.023%。無論是從微生物菌落的數(shù)量，還是從整體的PLFA群落結(jié)構(gòu)分析(PCA)，本研究都表明了放牧強度和圍封對土壤微生物群落有顯著的影響。

3.1 不同強度放牧對高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

不同強度放牧對土壤結(jié)構(gòu)的破壞程度有所不同，即高寒杜鵑灌叢草地圍封區(qū)和放牧區(qū)因其放牧強度的不同結(jié)果不盡相同。圍封處理下，土壤總PLFA量、細(xì)菌生物量、真菌生物量和放線菌生物量隨著放牧強度的增大而降低，且差異顯著(P<0.05)；G+/G-PLFA量比值在各個放牧強度間無顯著差異；細(xì)菌/真菌比值開始隨著放牧強度的增強開始顯著升高后無顯著差異；微生物壓力指數(shù)隨著放牧強度增強開始無顯著差異后又升高，且差異顯著(P<0.05)，主要是因為放牧強度增強，土壤的壓實程度加重，從而降低土壤的孔隙度，擴散到土壤中的氧氣的含量就比較少，好養(yǎng)細(xì)菌(16:1ω7c)的含量顯著降低。放牧處理下，土壤總PLFA量、細(xì)菌生物量、真菌生物量和放線菌生物量隨著放牧強度的增強而顯著降低；G+/G-PLFA量比值隨著放牧強度的增強而降低；細(xì)菌/真菌生物量比值在各個放牧強度間差異顯著(P<0.05)，在HG強度下比值達(dá)到最高，MG強度下比值最低，說明土壤生態(tài)系統(tǒng)在適度放牧下最穩(wěn)定，過度放牧將低了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；微生物壓力指數(shù)隨著放牧強度增強開始不變而后又降低，且差異顯著(P<0.05)，主要是由放牧強度增強，牲畜的踐踏使土壤變得緊實，通氣性下降，從厭氧細(xì)菌(cy17:0和cy19:0)的含量顯著降低造成。薩如拉等[31]研究放牧強度對典型草原土壤微生物特征的影響，表明土壤微生物總數(shù)量隨著放牧強度的增強而降低。但Wang和Sheng[32]對松嫩平原農(nóng)牧交錯帶天然草地的研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量隨放牧強度的增加呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，中牧地的土壤微生物數(shù)量最多。張成霞和南志標(biāo)[15]對隴東黃土高原天然草地土壤微生物研究發(fā)現(xiàn)：土壤微生物總數(shù)和細(xì)菌數(shù)量隨放牧強度的增大呈先減少后增多的趨勢，而真菌和放線菌數(shù)量隨放牧強度的增大而減少。譚紅妍等[33]在溫性草甸草原研究發(fā)現(xiàn)，土壤總微生物量、細(xì)菌和革蘭氏陰性菌生物量均隨著放牧強度的增加表現(xiàn)為先減少后增加的趨勢，而革蘭氏陽性菌、放線菌生物量則隨著放牧強度的增加而增加。土壤微生物各菌落生物量因研究區(qū)域不同而有差異，且不同強度放牧使灌叢草地地上部分生物量的差異使其根系的分泌物明顯不同，放牧強度不同其枯落物的質(zhì)量也不同，以上兩個方面均會影響杜鵑灌叢草地土壤微生物生長和代謝，從而影響微生物的數(shù)量和群論結(jié)構(gòu)。另外，放牧牲畜的排泄物對土壤微生物也會造成一定的影響。

3.2 不同強度圍封對高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

HG強度下，圍封處理的高寒杜鵑灌叢草地土壤總PLFA量、細(xì)菌生物量、真菌生物量、放線菌生物量、G+/G-PLFA和壓力指數(shù)高于放牧處理，而圍封處理的細(xì)菌/真菌比顯著低于放牧處理，且均差異顯著(P<0.05)。圍封和放牧處理的HG灌叢草地土壤中G+PLFA量均高于G-PLFA量，且圍封處理的HG灌叢草地土壤G+PLFA量和G-PLFA量均增加，但G+PLFA量增加的百分?jǐn)?shù)大于G-PLFA量增加的百分?jǐn)?shù)，導(dǎo)致G+/G-PLFA比顯著高于放牧處理。土壤細(xì)菌與真菌比值越低，土壤生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定[34-36]。此HG圍封處理后的灌叢草地土壤細(xì)菌/真菌比值降低，說明生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性升高?？赡苁且驗閲馓幚淼墓鄥膊莸氐厣系蚵湮镏泻懈嗟哪举|(zhì)素和多酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠誘導(dǎo)某些真菌生長，亦可能是圍封沒有牲畜的踐踏，保證了真菌菌絲體的完整性使真菌菌絲體結(jié)構(gòu)完整性的破壞減少，真菌生物量持續(xù)穩(wěn)定增長，從而降低了細(xì)菌與真菌的脂肪酸比值。圍封處理后的HG灌叢草地土壤厭氧細(xì)菌(cy17:0和cy19:0)和好氧細(xì)菌(16:1ω7c)均增加，但厭氧細(xì)菌增加的百分比大于好氧細(xì)菌，導(dǎo)致壓力指數(shù)升高。MG強度下，圍封處理后的土壤總PLFA量、細(xì)菌生物量、和細(xì)菌/真菌比值高于放牧處理，真菌生物量和壓力指數(shù)低于放牧處理，且均差異顯著(P<0.05)。圍封處理的MG灌叢草地土壤細(xì)菌/真菌增大，可能因為圍封處理后使動物排泄物減少，真菌吸收的營養(yǎng)減少，不利于真菌生長，導(dǎo)致真菌生物量有所降低，而細(xì)菌生物量增大，導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性下降，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。圍封處理的MG灌叢草地土壤厭氧細(xì)菌(cy17:0和cy19:0)和好氧細(xì)菌(16:1ω7c)均增加，但好氧細(xì)菌增加的百分比大于厭氧細(xì)菌，導(dǎo)致壓力指數(shù)降低。LG強度下，圍封處理后的土壤生物量和生物量比值均無顯著差異。原因可能是由放牧強度較輕，圍封作用不明顯，圍封內(nèi)外土壤穩(wěn)定結(jié)構(gòu)沒有顯著差異所造成。趙帥等[37]在內(nèi)蒙古針茅草原上的研究表明，圍欄條件下，土壤細(xì)菌脂肪酸與總PLFA含量均顯著高于放牧草地；放牧導(dǎo)致各類型草原革蘭氏陽性細(xì)菌PLFA/革蘭氏陰性細(xì)菌PLFA(G+/G-)比值顯著降低，而除了克氏針茅草原，細(xì)菌/真菌PLFA則顯著升高。究其原因可能為兩地圍封管理方式，放牧強度和草地類型不同所致，再者，放牧強度增加，牲畜踐踏對土壤穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的破壞程度增加，使土壤微生物生物量降低。張莉等[38]以放牧為對照，應(yīng)用PLFA法分析研究圍封后高寒草甸土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，圍封處理的微生物總量、土壤細(xì)菌、G+、G+/G-和真菌均小于放牧處理，但其細(xì)菌/真菌和放線菌生物量高于放牧處理，圍封處理降低了微生物的土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。由于牲畜踐踏改變了土壤的緊實度，使土壤孔隙度和水穩(wěn)性團聚體減少，引起透水性、透氣性和水導(dǎo)率下降，土壤微環(huán)境改變，土壤微生物的繁殖代謝受到強烈的干擾，造成圍封樣地的土壤微生物PLFAs量顯著高于放牧樣地。Bardgett等[39]的研究發(fā)現(xiàn)：長期圍封地表層土壤真菌豐富度和真菌/細(xì)菌PLFA值顯著低于放牧地。此研究結(jié)果與本研究中MG杜鵑灌叢草地土壤真菌PLFA和細(xì)菌/真菌PLFA值研究結(jié)果一致。Bardgeett等[28]使用PLFA技術(shù)對不同放牧管理程度的草原土壤以及不同草原類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)開展研究，結(jié)果顯示放牧顯著降低了土壤微生物PLFAs生物量，這與本研究結(jié)果一致。高鳳等[40]對藏北古露高寒草地生態(tài)系統(tǒng)研究表明，短期圍封使土壤微生物生物量(細(xì)菌、放線菌、真菌)均呈顯著增加，能維持土壤微生物多樣性。

主成分分析表明，不同的放牧強度和不同的利用方式(圍封和放牧)對高寒杜鵑灌叢草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且圍封處理的影響程度大于放牧處理。說明利用方式和放牧強度對于微生物群落的影響不僅在于微生物生物量的變化，也影響微生物群落結(jié)構(gòu)。

相關(guān)性分析表明，不同放牧強度下土壤結(jié)構(gòu)及微生物可利用營養(yǎng)元素輸入的變化是引起微生物群落結(jié)構(gòu)變化的可能原因之一。韓世忠等[41]利用磷脂脂肪酸(PLFA)生物標(biāo)記法在中亞熱帶地區(qū)羅浮栲天然林和相鄰的杉木人工林研究表明，土壤微生物主要類群PLFAs含量與總氮、有機碳、C/N和銨態(tài)氮均呈顯著正相關(guān)。吳則焰等[42]研究結(jié)果表明，真菌類群與土壤養(yǎng)分因子都呈負(fù)相關(guān)，且與總有機碳、全氮之間呈顯著負(fù)相關(guān)，表明真菌比其他微生物類型更能適應(yīng)養(yǎng)分貧瘠的條件。由于放牧強度的增強，在一定程度上限制了土壤微生物的活動，進而影響了生態(tài)系統(tǒng)中土壤養(yǎng)分和土壤結(jié)構(gòu)等的變化。在輕度放牧灌叢草地，自然植被良好，地上生物量相對較大，土壤微生物數(shù)量大，生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性高。因此在當(dāng)?shù)鬲毺氐臍夂驐l件影響下，隨著放牧強度的加重，植被種類結(jié)構(gòu)趨向簡單化，植被和微生物總量減少，土壤理化性質(zhì)惡化，導(dǎo)致土壤全氮和有機質(zhì)含量下降。

盡管PLFA技術(shù)常被用于研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，但該技術(shù)本身也有局限性。PLFA能定量描述環(huán)境樣品中的微生物群體，而不能在菌種和菌株的水平精確的描述環(huán)境中微生物的種類，因此，要全面解析土壤微生物群落及其結(jié)構(gòu)特征，還需結(jié)合BIOLOG鑒定系統(tǒng)和分子生物學(xué)等其他的研究手段。