亓 琳，李艷玲，趙 威，王曉凌

1 河南科技大學農(nóng)學院，洛陽 471023 2 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085

鍶-90是一種放射性金屬，為鈾-235和钚-239的裂變產(chǎn)物，形成于核武器和核反應堆爆炸[1]。放射性同位素具備重金屬和放射性的雙重毒性。已有研究表明，放射性核素在環(huán)境中與其穩(wěn)定性同位素在環(huán)境中的行為相似。因此，觀察穩(wěn)定鍶-88在土壤和植物中的行為，是一個預測模擬其放射性同位素鍶-90的方法[2]。

修復污染土壤的最終目標不僅是清除或減少土壤中的污染物，更有價值的是恢復土壤質(zhì)量[3]。通過評價土壤中活性成分的指標可以判斷污染土壤植物修復的效果。土壤微生物對于外界環(huán)境的擾動相當敏感，能夠有效地表征土壤環(huán)境中生物化學過程的強度、方向以及土壤微環(huán)境的改變，并對重金屬污染相當敏感[4]。土壤酶在土壤中養(yǎng)分循環(huán)和能量流動的過程中起著至關(guān)重要的作用，與物質(zhì)與能量的轉(zhuǎn)化、生態(tài)環(huán)境質(zhì)量以及植物生長密切相關(guān)[5]。BIOLOG技術(shù)被表征環(huán)境中土壤微生物群落的功能多樣性和碳源利用動力學特征，并被廣泛應用于評價重金屬污染對微生物群落的影響[6]。

燕麥(AvenasativaL.)是主要的高寒作物之一，為上等雜糧。燕麥在華北、西北和青藏高原等高寒及半干旱地區(qū)廣泛種植。燕麥的生物量大、根系發(fā)達、生長速度快以及耐鹽脅迫等特點有利于對土壤中污染物的吸附[7]。在我們先前的研究中，比較了小麥、燕麥和大麥的鍶富集能力，從26個麥類作物品種中篩選出了鍶富集能力最強的燕麥品種—內(nèi)蒙科藝1號[8]。在本研究中，內(nèi)蒙科藝1號被選為供試植物，通過研究土壤酶(轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶)活性和微生物群落功能多樣性的響應以評價種植燕麥對鍶污染土壤的修復效果，以期對鍶污染土壤的植物修復研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

燕麥(AvenasativaL.)種子購于河南省洛陽市農(nóng)資市場，選擇籽粒飽滿、大小一致的燕麥種子，經(jīng)0.2%次氯酸鈉表面消毒20 min后，用水浸種10 min，以去除種子表皮上的病菌，風干。實驗用土采集于河南科技大學周山校區(qū)的農(nóng)場土壤表層土(0—20 cm)，采用土壤農(nóng)化分析方法測定其理化性質(zhì)[9]。供試土壤基本理化性質(zhì)為：pH值為8.05、有機質(zhì)含量為12.85 g/kg、全氮含量為0.96 g/kg、速效磷含量12.52 mg/kg、速效鉀含量155.13 mg/kg、陽離子交換量為19.23 cmol/kg、鍶含量為25.06 mg/kg。

1.2 試驗設計

采用土培盆栽試驗，種植于塑料盆中(高=16 cm，底徑=12 cm，口徑=22 cm)。每盆中裝的風干土2 kg。將分析純試劑SrCl2· 6H2O溶于水中制成溶液，然后將該溶液均勻地拌入土壤中，設置3個Sr2+濃度梯度，分別為0，75，225 mg/kg，其中Sr2+濃度為0的土壤為對照組。土壤本底值為25.06 mg/kg，將鍶處理濃度設置為本底值的4倍和10倍[10- 11]。因此，最終土壤中的金屬鍶濃度為25 mg/kg(CK)，100 mg/kg(L)和250 mg/kg(H)。金屬鍶在土壤中“老化”處理30 d。每盆播種20粒種子，出苗后定苗，每盆12株。本試驗設置6個處理包括：1)CK、2)L、3)H、4)CK+燕麥、5)L+燕麥、6)H+燕麥。所有處理設置5個重復。澆灌期間通過稱重法添加自來水，保持田間持水量的60%。在鍶處理30 d后采樣，取燕麥根際土。用土鉆將每盆中燕麥的根系從土壤中挖出，盡量保持根系的完整性，采用 “抖根法”去掉和根系結(jié)合松散的土體土，取與根系緊密結(jié)合的土壤。將一盆中獲取的根際土混合視為一個樣品。根際土樣過2 mm篩以除去雜物，然后置于4 ℃下保存，待測[12- 13]。

1.3 土壤酶活性的測定

轉(zhuǎn)化酶活性測定采用3, 5-二硝基水楊酸比色法，蛋白酶活性測定采用茚三酮比色法，磷酸酶活性測定采用對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)比色法，脲酶活性測定采用靛酚藍比色法，脫氫酶活性測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[14]。

1.4 土壤微生物功能多樣性分析

稱取相當于風干土10 g的土樣加入到裝有100 mL的0.85%無菌氯化鈉(NaCl)的三角瓶中，室溫震蕩60 min(200 r/min)，采用10倍稀釋法，然后用NaCl溶液稀釋至濃度10-3。將稀釋液接種到Biolog生態(tài)板(ECO MicroPlate，美國Matrix Technologies Corporation生產(chǎn))中，每孔加150 μL。將接種好的ECO板裝入(25±1) ℃的恒溫暗箱培養(yǎng)，每隔12 h用ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附測定)讀取光密度值(590 nm)，連續(xù)培養(yǎng)144 h[15]。

1)采用孔平均顏色變化率法(Average Well Color Development，AWCD)測定土壤微生物利用單一碳源的能力。

AWCD=∑(Ci-Ri)/31

式中，Ci為每個孔的光密度值，Ri為對照孔的光密度值，31為碳源總數(shù)。

2)群落Shannon指數(shù)(H)

H=-∑Pi(lnPi)

式中，Pi=(Ci-Ri)/∑Ci-Ri。表示有碳源的孔與對照孔 A1 的光密度值之差與整板總差的比值。

3)碳源利用豐富度指數(shù)(S)

S=被利用碳源的總數(shù)

4)Shannon 均勻度指數(shù)(E)

E=H/logS

5)Shannon 優(yōu)勢度指數(shù)(D)

本試驗采用BIOLOG微平板培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)分析微生物代謝多樣性。

1.5 統(tǒng)計分析

以鍶添加量為固定因素(自變量)，對所有參數(shù)(因變量)進行單因素方差分析。處理之間差異的顯著性在P<0.05概率水平以最小顯著性差異(LSD)進行判定。所有統(tǒng)計分析都是用SPSS軟件(version 13.0；SPSS Institute Chicago，IL，USA)來進行。各圖表中的數(shù)據(jù)均為5個重復的平均值。

2 結(jié)果

2.1 在鍶污染下燕麥對土壤酶活性的影響

如表1所示，在L和H處理中，轉(zhuǎn)化酶活性與對照相比分別減少了7%和21%，磷酸酶活性與對照相比分別減少了13%和17%，蛋白酶活性與對照相比分別減少了5%和13%，脲酶活性與對照相比分別減少了16%和29%，脫氫酶活性與對照相比分別減少了6%和22%。這一結(jié)果表明金屬鍶脅迫顯著抑制了土壤酶活性，抑制效應隨著金屬鍶濃度的升高而增強。

表1 不同鍶處理下燕麥對土壤酶活性的影響

CK：對照，control check；L：低濃度鍶，low concentration of strontium；H：高濃度鍶，high concentration of strontium; 不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)

在CK處理中種植燕麥后，種植燕麥處理與未種植處理相比，5種酶的活性增加。與CK相比，轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶和蛋白酶活性分別增加了2%、3%和2%，但未達到顯著性差異(P>0.05)；而脲酶和脫氫酶活性分別增加了13%和7%，處理之間達到顯著性差異(P<0.05)。在L處理中種植燕麥后，與L處理相比，轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶活性分別增加了7%、10%、3%、12%和11%；除蛋白酶活性未達到顯著性差異(P>0.05)，其他4種酶活性在處理之間差異顯著(P<0.05)。在H處理中種植燕麥后，與H處理相比，轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶活性分別增加了4%、7%、4%、9%和10%；轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶和蛋白酶活性在處理之間差異不顯著(P>0.05)，但脲酶和脫氫酶活性在處理之間達到顯著性差異(P<0.05)。

2.2 在鍶污染下燕麥對AWCD的影響

光密度平均顏色變化率(AWCD)能夠被用來比較土壤微生物利用總體碳源的能力，AWCD 越大，表明微生物的代謝活性越強。如圖1所示，隨著培育時間的延長，AWCD逐漸升高。添加金屬鍶處理與對照相比，其AWCD的排列順序為：CK>L>H。種植燕麥與無種植處理相比，其AWCD的排列順序為：CK+燕麥>CK；L+燕麥>L；H+燕麥>H。這一結(jié)果表明在鍶脅迫條件下種植燕麥能顯著恢復微生物對碳源的利用能力。在24h之前AWCD的值一直很小，不同處理間的AWCD值接近于零，表明在培育24 h之內(nèi)碳源基本上沒有被利用。在溫育24 h之后，AWCD大幅度增加，表明此后碳源被大量消耗。其中CK和CK+燕麥處理AWCD增加的速度較快，而H處理AWCD增加的速度較慢。綜合所有的處理的AWCD，其排序為：CK+燕麥>CK>L+燕麥>H+燕麥>L>H。

圖1 不同處理AWCD隨培育時間的變化Fig.1 AWCD changes with incubation time in different treatments注：CK：對照，control check；L：低濃度鍶，low concentration of strontium；H：高濃度鍶，high concentration of strontium

2.3 在鍶污染下燕麥對土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響

從圖2可以看出，土壤微生物對碳源利用的Shannon多樣性指數(shù)(H)在L和H處理中顯著最低(P<0.05)。Shannon均勻度指數(shù)(E)在CK+燕麥處理中最高(P<0.05)。豐富度指數(shù)(S)在所有處理中的表現(xiàn)為：CK、CK+燕麥>L 、L+燕麥>H+燕麥>H。而Shannon均勻度指數(shù)(E)與上述指數(shù)有所不同，表現(xiàn)為H>L>L+燕麥、H+燕麥>CK>CK+燕麥。在種植燕麥處理中，相對于L+H處理，L+燕麥和H+燕麥處理顯著提高了土壤微生物群落中物種多樣性和豐富度(P<0.05)，而均勻度和優(yōu)勢度在種植和無種植處理之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 鍶脅迫下燕麥對土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響Fig.2 Effect of oats on the diversity indices of soil microbial communities under Sr stress

2.4 微生物碳源利用的主成分分析

如表2所示，對培養(yǎng)72 h的31種碳源利用情況進行主成分分析，共提取3個主成分：第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)和第三主成分(PC3)，分別可以解釋所有變量的54.24%、24.28%和21.48%。3個主成分累積方差貢獻率達到100%，可以全面地反映31個變量的特征，并據(jù)其得分來表征微生物群落碳源代謝特征。不同的處理中，CK+燕麥在PC1上得分最高，L+燕麥在PC2上得分最高，H+燕麥在PC3上得分最高。

表2 主成分得分及貢獻率

因子載荷反映了主成分與碳源利用的相關(guān)程度，因子載荷絕對值越接近于1，表示該碳源對主成分的影響越大。如表3所示，與第一主成分相關(guān)性較高的碳源有14個，主要包括酚酸類化合物：4-羥基苯甲酸；胺類化合物：腐胺；聚合物：吐溫40、吐溫80 和 α-環(huán)式糊精；氨基酸：L-苯丙氨酸；羧酸類化合物：丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸；碳水化合物：D-半乳糖內(nèi)酯、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺、D-甘露醇。與第二主成分相關(guān)性較高的碳源有5個，主要包括酚酸類化合物：2-羥基苯甲酸；胺類化合物：苯乙基胺；聚合物：肝糖；氨基酸：L-絲氨酸；碳水化合物：D-木糖。與第三主成分相關(guān)性較高的碳源有4個，主要包括羧酸類化合物：D-蘋果酸；聚合物：肝糖；羧酸類化合物：D-葡萄胺酸；碳水化合物：葡萄糖-1-磷酸鹽。

表3 31種碳源的因子載荷

如表4所示，金屬鍶添加處理顯著降低了碳水化合物、羧酸類碳源的利用率。在L處理中，碳水化合物和羧酸類碳源的利用率分別下降了9% 和34%；在H處理中，碳水化合物和羧酸類碳源的利用率分別下降了25%和47%；且達到顯著性差異(P<0.05)。聚合物類、氨基酸類和酚類碳源的利用也稍有下降，但與CK相比差異不顯著(P>0.05)。與未種植處理相比(CK、L和H)，種植燕麥顯著增加了羧酸類和聚合物類碳源的利用率。在CK處理種植燕麥后，羧酸類和聚合物類碳源的利用率分別增加了19%和31%；在L處理種植燕麥后，羧酸類和聚合物類碳源的利用率分別增加了24%和41%；在H處理種植燕麥后，羧酸類和聚合物類碳源的利用率分別增加了30%和38%，且達到顯著性差異(P<0.05)。碳水化合物、聚合類、酚類和氨基酸類碳源的利用也稍有增加，但與L和H相比差異不顯著(P>0.05)。綜合表3和表4可知，碳水化合物、聚合物和羧酸類化合物是燕麥種植處理下根際土壤微生物利用的主要碳源。

表4 在鍶脅迫下燕麥對土壤微生物群落碳源利用特征的影響(OD590)

圖3 土壤微生物碳源利用聚類分析 Fig.3 Cluster analysis of carbon utilization by soil microbial communities

2.5 土壤微生物群落多樣性指數(shù)的聚類分析

為了更清晰的了解不同處理間在土壤微生物群落代謝的特征，對培養(yǎng)72 h的31種碳源的利用情況進行聚類分析。聚類分析根據(jù)樣本的數(shù)據(jù)特征按照性質(zhì)上的親疏程度進行自動分類，類別內(nèi)部的樣本在特征上具有相似性，不同類別間的樣本特征差異較大。從圖3可以看出，當聚類距離≤5時，L+燕麥和H+燕麥處理聚為一類，L和H處理聚為一類，CK和CK+燕麥處理聚為一類。當聚類距離≤10時，L+燕麥、H+燕麥、L和H處理聚為一類，而CK和CK+燕麥處理聚為一類。說明L+燕麥、H+燕麥、L和H處理中微生物群落代謝特性趨于一類，并且L+燕麥和H+燕麥處理在聚類關(guān)系上趨同性更強，而CK和CK+燕麥處理與其他處理間差異較大。

3 討論

3.1 在鍶污染下燕麥對土壤酶活性的影響

土壤酶系統(tǒng)是土壤有機體中的代謝動力，能催化土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物化學過程，表征土壤的生態(tài)功能、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化進程的強度和方向[16]。土壤轉(zhuǎn)化酶、磷酸酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶參與土壤中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，對土壤質(zhì)量和健康狀況非常敏感。土壤污染日益嚴重，土壤酶常用來表征污染物潛在毒性。土壤酶活性變化可以作為土壤重金屬污染水平的指標[17]。重金屬離子與底物競爭酶活性中心，結(jié)合于酶蛋白的必需基團巰基和咪唑基團形成了穩(wěn)定的金屬螯合物，或者重金屬對土壤微生物的生長和代謝過程產(chǎn)生抑制作用[18]。本研究中土壤酶活性的降低可能有兩個原因：鍶與土壤酶蛋白的關(guān)鍵基團和配位鍵結(jié)合從而使酶失活，另一方面鍶脅迫下微生物體內(nèi)酶的合成和分泌減少。重金屬通過干擾功能，使蛋白變性和破壞細胞膜完整性，以影響土壤微生物的新陳代謝。土壤酶來自動、植物和微生物的活體或殘體的分泌和釋放，對土壤中養(yǎng)分的循環(huán)至關(guān)重要[19]。種植燕麥處理顯著提高了土壤脲酶和脫氫酶活性。這一結(jié)果說明種植燕麥可以顯著地改善鍶處理對土壤酶的抑制作用。一方面，燕麥通過富集作用，能夠吸收鍶進入到植物體內(nèi)，并清除土壤一定比例的鍶，減輕土壤中鍶的污染程度。根系分泌物作用于土壤微生境，可以改善土壤環(huán)境和提高酶活性；另一方面，土壤酶活性的變化間接表明某些營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化情況，較高的土壤酶活性在一定程度上保證燕麥生長所需的營養(yǎng)。

3.2 在鍶污染下燕麥對土壤微生物群落功能多樣性的影響

基于微生物代謝的Biolog微平板法，在環(huán)境微生物群落研究應用廣泛。Biolog技術(shù)在污染物對微生物生存環(huán)境的擾動評價以及環(huán)境的修復效果評價等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝活性與污染物的種類和程度密切相關(guān)，重金屬暴露濃度與微生物代謝活性之間呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系，并能降低微生物群落功能多樣性[20]。由于Biolog-ECO板在培育過程中顏色的變化可能是處理土壤之間微生物群落組成的差異造成的，也可能是由于微生物群落大小的差異引起的[21]。因此，比較Shannon多樣性指數(shù)對于評價種植燕麥對鍶污染土壤的修復效果非常有必要。土壤微生物對碳源利用的Shannon多樣性指數(shù)(H)在L和H處理中最低(P<0.05)。Shannon均勻度指數(shù)(E)在CK+燕麥處理中最高(P<0.05)。豐富度指數(shù)(S)在所有處理中的表現(xiàn)為：CK、CK+燕麥>L、L+燕麥>H+燕麥>H。這一結(jié)果說明重度鍶污染顯著抑制了土壤微生物群落的豐富度、多樣性及均勻度。而Shannon優(yōu)勢度指數(shù)(D)與上述指數(shù)有所不同，表現(xiàn)為H>L>L+燕麥、H+燕麥>CK>CK+燕麥。這一結(jié)果表明在重度鍶污染條件下，土壤中生物群落分異演化出優(yōu)勢種以適應金屬鍶脅迫。在種植燕麥處理中，相對于L+H處理，L+燕麥和H+燕麥處理顯著提高了土壤微生物群落中物種多樣性和豐富度(P<0.05)，而均勻度和優(yōu)勢度在種植和無種植處理之間無顯著性差異(P>0.05)。這一結(jié)果表明種植燕麥顯著提高了土壤微生物群落的豐富度和多樣性。種植燕麥在一方面清除了土壤中一定量的金屬鍶，減輕了土壤污染程度；另一方面通過凋落物和釋放分泌物為土壤微生物提供碳源，改善土壤微環(huán)境，增加微生物碳源的可利用性，由此增加土壤微生物群落多樣性指數(shù)[22]。

主成分分析采用降維的思路，分析在不同鍶濃度處理下，種植燕麥對土壤微生物碳源利用的影響是否存在差異。郭星亮等[23]研究了重金屬污染對銅川煤礦礦區(qū)微生物群落代謝的影響，主成分分析的結(jié)果表明重金屬污染顯著抑制了微生物的代謝活性，主要體現(xiàn)在糖類和氨基酸類碳源的利用上，這與本文的研究結(jié)果較為一致。不同的鍶濃度對土壤微生物群落的影響不同。主成分分析表明種植燕麥對金屬鍶污染土壤中微生物的碳源底物的利用能力相關(guān)。在第一主成分上，解釋了大部分的變異，CK+燕麥處理對土壤微生物群落功能影響最大。在第二主成分上，L+燕麥處理得分最高，說明高濃度的鍶處理影響土壤微生物群落功能。在第三主成分上，H+燕麥處理得分最高，說明在金屬鍶污染土壤中種植燕麥能夠影響土壤微環(huán)境，改變其微生物群落結(jié)構(gòu)，最終使鍶污染土壤中的微生物碳源代謝發(fā)生改變。重金屬鍶進入土壤后，改變了土壤微環(huán)境，為了適應重金屬鍶的脅迫環(huán)境，微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了分異。在重金屬污染條件下，土壤微生物群落功能多樣性顯著降低，能夠代謝相關(guān)碳源作為底物的微生物數(shù)量相對減少，最終微生物對單一碳源底物的利用能力被減弱[24]。因子載荷反映了主成分與碳源利用的相關(guān)程度，因子載荷絕對值越接近于1，表示該碳源對主成分的影響越大。碳水化合物、聚合物和羧酸類化合物是燕麥處理下根際土壤微生物利用的主要碳源。這一結(jié)果與碳源利用率中的結(jié)果相一致。鍶添加處理顯著降低了碳水化合物和羧酸類碳源的利用率，且達到了顯著性差異。聚合物類、氨基酸類和酚類碳源的利用率也稍有下降，但與CK相比差異不顯著。燕麥通過其根系分泌和釋放代謝產(chǎn)物至土壤中為微生物的生長和繁殖提供了營養(yǎng)和能源，促進微生物大量繁殖并增強微生物代謝活性。燕麥顯著增加了羧酸類和聚合物類碳源的利用率。其他類碳源的利用率也稍有增加，但與L和H相比差異不顯著。在鍶污染土壤中種植燕麥，土壤中微生物群落代謝活性增強，微生物群落利用碳源的能力增加。在聚類分析中，CK和CK+燕麥分為一類，L和H分為一類，L+燕麥和H+燕麥分為一類。CK和CK+燕麥類別和L+燕麥和H+燕麥類別的歐式距離較小，且與L和H類別的歐式距離較大。這一結(jié)果說明土壤鍶污染與土壤微生物群落的代謝特性關(guān)系密切，而種植燕麥顯著影響了土壤微環(huán)境，與土壤酶活性和主成分分析的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

種植燕麥顯著提高鍶污染土壤中脲酶和脫氫酶活性，并顯著提高鍶污染土壤微生物對31種碳源的平均利用率(AWCD)、鍶污染土壤微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)(H)、Shannon均勻度指數(shù)(E)和碳源利用豐富度指數(shù)(S)。主成分分析表明種植燕麥影響了鍶污染土壤微生物群落功能多樣性，增加了羧酸類和聚合類碳源的利用率?；谝陨辖Y(jié)果，在鍶污染土壤中，燕麥顯著提高了酶活性，改善了微生物功能多樣性。