劉 曉，邱嫵潔，李新梅，闞云超，李丹丹

(南陽師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 南陽 473061)

0 引言

非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA) 是指一類不能編碼蛋白質(zhì)但能夠行使功能的RNA的總稱.依據(jù)其成熟體的序列長(zhǎng)度可分為3大類：小于50 nt的ncRNA，包括 microRNA ( miRNA)、small interference RNA( siRNA)、piwi interacting RNA (piRNA)等；中等長(zhǎng)度的ncRNA，包括snRNA、snoRNA等；大于500 nt的ncRNA，如long non-coding RNA (lncRNA)等[1].目前對(duì)家蠶miRNA的研究較多，在miRbase數(shù)據(jù)庫中公布的家蠶成熟miRNA共563條[2-9]，對(duì)其功能的研究也在逐步加深.如miRNA-965 和miRNA-1926靶基因是家蠶絲素重鏈基因Fib-H，在個(gè)體中過表達(dá)miRNA-965 和miRNA-1926會(huì)導(dǎo)致Fib-H表達(dá)水平下調(diào)[10].在家蠶5齡3天幼蟲后部絲腺高表達(dá)bmo-miR-0001和bmo-miR-0015，能抑制家蠶絲素蛋白輕鏈基因Fib-L的表達(dá)[11].在家蠶個(gè)體中干涉let-7表達(dá)，可上調(diào)蛻皮激素信號(hào)通路基因E74、FTZ-F1表達(dá)，從而導(dǎo)致家蠶變態(tài)發(fā)育停滯[12].而MicroRNA281能抑制蛻皮激素受體BmEcR-B的表達(dá)，從而參與家蠶發(fā)育調(diào)控[13].在長(zhǎng)鏈非編碼RNA研究方面，WU等[14]從家蠶18個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)庫中獲得的11810個(gè)新的lncRNA.ZHOU等[15]比較了野生蠶和家蠶絲腺中的lncRNA，發(fā)現(xiàn)3個(gè)lncRNA的表達(dá)量在家蠶和野生蠶之間存在顯著差異，表明它們可能會(huì)通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響蠶絲產(chǎn)量.

目前，雖然在家蠶非編碼RNA方面開展了較多的工作，但是對(duì)家蠶中等長(zhǎng)度ncRNA功能的解析還較少[16,17-19].越來越多的研究表明，中等長(zhǎng)度的RNA如snoRNA，除了能夠指導(dǎo)rRNA和tRNA的2’-O-核糖的甲基化和假尿嘧啶化修飾外，具有更多新的功能[20,21].例如，在人和小鼠腦中特異性表達(dá)的SNORD115 (H/MBII-52) 和SNORD116 (H/MBII-85)，可調(diào)控5-羥色胺受體5-HT2cR基因的選擇性剪接和RNA編輯，它們的缺失可能是形成Prader-Willi綜合癥的主要誘因[22-25].同時(shí)，snoRNA的表達(dá)水平可以影響細(xì)胞、組織和器官的生理狀況，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[28].如與正常未遷移人類乳腺細(xì)胞MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞系ZR-75-1中boxC/D snoRNAs(U22, U3, U8, U94, U97)表達(dá)水平明顯升高[27].box H/ACA snoRNA42在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象，已被鑒定為肺癌的致癌基因[28].Wu等研究發(fā)現(xiàn)核仁小分子RNA 中ACA11能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路來促進(jìn)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而增加細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達(dá)并誘導(dǎo)發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，因此ACA11將可能選為生物治療靶標(biāo)[29].另外，Angrisani等發(fā)現(xiàn)參與果蠅發(fā)育調(diào)控中的snoRNA表達(dá)呈現(xiàn)出不一致的現(xiàn)象[30].

在前期研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)絲腺高表達(dá)的ncRNA Bm-152，其在細(xì)胞核、質(zhì)中均有分布.同時(shí)Bm-152可結(jié)合在snoRNA protein complex (snoRNP)中[16,31].為了進(jìn)一步探索Bm-152的功能，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Bm-152在家蠶5齡幼蟲及預(yù)蛹期絲腺不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)變化.同時(shí)絲腺的發(fā)育離不開激素信號(hào)通路的調(diào)控，為了進(jìn)一步研究是否通過蛻皮激素或保幼激素信號(hào)通路參與家蠶發(fā)育調(diào)控，我們?cè)诩倚Q5齡幼蟲血淋巴中注射piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152] 過表達(dá)載體，檢測(cè)Bm-152、蛻皮激素和保幼激素信號(hào)通路基因Usp、E75A、Met表達(dá)量的變化，為進(jìn)一步探索家蠶ncRNA Bm-152功能提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

家蠶品系為大造P50，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所李木旺研究員惠贈(zèng).

Trizol RNA提取試劑(Invitrogen)，Premix Extaq酶(Takara)，F(xiàn)astDigest內(nèi)切酶(Fermentas)，DNA膠回收試劑盒(Axygen)，T4連接酶(Fermentas)，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green熒光定量PCR試劑(Roche).

1.2 方法

1.2.1 家蠶飼養(yǎng)及取樣方法

飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%，光周期12L:12D，用新鮮桑葉飼養(yǎng).從家蠶5齡第1天至預(yù)蛹期第1天(家蠶5齡共7天，吐絲期3天，預(yù)蛹期1天)，每天取絲腺組織，速凍于液氮中.

1.2.2 載體構(gòu)建

利用昆蟲多基因表達(dá)載體pFBDM(由Richmond教授惠贈(zèng))[16]作為中間載體構(gòu)建Bm-152過表達(dá)載體.首先利用Trizol法提取家蠶絲腺總RNA，Ramdom引物反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，利用ExTaq酶PCR 擴(kuò)增Bm-152.以伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的piggyBac[A3-EGFP]載體為模板，擴(kuò)增actinA3啟動(dòng)子.BmHI、NcoI雙酶切actinA3啟動(dòng)子，連接在pFBDM載體上，獲得pFBDM[A3]載體.NcoI、KpnI雙酶切Bm-152 PCR產(chǎn)物，連接在pFBDM[A3]上，獲得pFBDM[A3-Bm-152]載體.BamHI、BglII雙酶切pFBDM[A3-Bm-152]載體，BglII雙酶切piggyBac[A3-EGFP]，連接獲得piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體.陰性對(duì)照為實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建成功的piggyBac[A3-EGFP-A3-mecherry]載體(構(gòu)建方法同piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體).

1.2.3 個(gè)體注射

利用脂質(zhì)體攜帶載體的方法注射5齡3天幼蟲血淋巴，分別注射2 μg piggyBac[A3-EGFP-A3-mcherry]載體和2 μg piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體，各注射6頭家蠶，2頭為一組，生物學(xué)重復(fù)3個(gè).注射后48 h解剖幼蟲，分絲腺和非絲腺組織，速凍于液氮中.空白對(duì)照為5齡3天正常培養(yǎng)48 h后的家蠶.

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Trizol法提取總RNA.取不同組織的總RNA各2 μg，使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA.利用表1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(FastStart Universal SYBR Green，Roche).PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 變性30 s；55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán).U6和actinA3為內(nèi)參基因.PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(其中，Ct為循環(huán)閾值，表示每一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過設(shè)定的閾值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)；△Ct=目的基因的Ct平均值-內(nèi)參基因的Ct平均值，△△Ct為兩個(gè)樣本的△Ct之間的差值).

表1 基因的PCR擴(kuò)增引物Tab. 1 Primer sequences of genes

注：表中的下劃線“＿”代表限制性酶切位點(diǎn) .

2 結(jié)果

2.1 Bm-152在家蠶絲腺中的表達(dá)譜

為了獲得Bm-152在家蠶絲腺中的表達(dá)情況，我們選取5齡第1天到預(yù)蛹期共11天的家蠶絲腺為研究對(duì)象，提取總RNA，Random引物反轉(zhuǎn)為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bm-152在家蠶不同發(fā)育時(shí)期絲腺中的表達(dá)量.結(jié)果如圖1所示，Bm-152在家蠶5齡幼蟲絲腺發(fā)育過程中無明顯的變化規(guī)律，但在吐絲第1天表達(dá)量較高，隨后表達(dá)量又下調(diào).

2.2 Bm-152過表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

將前期擴(kuò)增的actinA3啟動(dòng)子和Bm-152雙酶切后，依次連接在pFBDM載體上，構(gòu)建出重組載體pFBDM[A3-Bm-152].雙酶切結(jié)果如圖2所示，經(jīng)NcoI、KpnI雙酶切獲得Bm-152，位置在135 bp左右(第3泳道).經(jīng)BmHI、NcoI雙酶切，獲得actinA3啟動(dòng)子，大小為820 bp(第4泳道)，酶切結(jié)果顯示目的條帶單一，位置正確.將pFBDM[A3-Bm-152]經(jīng)BamHI和BglII雙酶切后的片段連接在piggyBac[A3-EGFP]上，獲得piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體，測(cè)序表明重組載體構(gòu)建成功.

圖1 Bm-152在家蠶絲腺中的表達(dá)情況Fig. 1 Expression profiles of Bm-152 in the silk gland of Bombyx mori

注：1-7為5齡第1天到第7天，8-10為吐絲期，11為預(yù)蛹期第1天

圖2 pFBDM[A3-Bm-152]雙酶切產(chǎn)物電泳分析Fig. 2 Electrophoresis analysis of enzyme digestion products of pFBDM[A3-Bm-152]

注：Marker為DL2000；1為原始重組載體，2為NcoI、KpnI雙酶切產(chǎn)物，3為BmHI、NcoI雙酶切產(chǎn)物，4為BmHI、KpnI雙酶切產(chǎn)物

2.3 個(gè)體注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Bm-152基因在家蠶非絲腺組織和絲腺中表達(dá)變化

為了進(jìn)一步探索Bm-152的功能，將構(gòu)建好的piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體和piggyBac [A3-EGFP-A3-mCherry]載體注射家蠶5齡第3天幼蟲血淋巴，注射量為2 μg，48 h取樣檢測(cè)Bm-152的表達(dá)變化.結(jié)果如圖3所示，注射后Bm-152在非絲腺組織實(shí)現(xiàn)明顯過表達(dá)，但在絲腺中無明顯變化，表明actinA3啟動(dòng)子在絲腺中過表達(dá)效果不明顯.

圖3 Bm-152在家蠶非絲腺和絲腺中的表達(dá)變化Fig. 3 Changes of Bm-152 in the non-silk gland and slik glandof Bombyx mori

注：*表示差異顯著(P<0. 05)，**表示差異極顯著(P<0. 01)

2.3.2 E75A、USP和 Met在家蠶非絲腺組織中的表達(dá)變化

為了進(jìn)一步探索Bm-152可能參與的信號(hào)途徑，選擇與家蠶變態(tài)發(fā)育相關(guān)性最強(qiáng)的蛻皮激素和保幼激素信號(hào)通路基因?yàn)檠芯繉?duì)象，進(jìn)一步探索Bm-152是否參與激素調(diào)控的家蠶變態(tài)發(fā)育.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射2 μg piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體后，蛻皮激素受體復(fù)合物EcR-USP中Usp基因的表達(dá)量變化明顯，上調(diào)1.95倍，蛻皮激素信號(hào)通路下游E75A基因的表達(dá)量變化顯著，上調(diào)2.26倍.對(duì)保幼激素信號(hào)通路基因Met而言，在注射2 μg piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體后，其表達(dá)量變化明顯，上調(diào)1.79倍(圖4).

圖4 轉(zhuǎn)染piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體和piggyBac [A3-EGFP-A3-mCherry] 載體后USP、E75A和Met在家蠶非絲腺組織中的表達(dá)情況Fig. 4 Expression of USP、E75A and Met in the non-silk gland after transfection of piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152] overexpression vector and piggyBac [A3-EGFP-A3-mCherry] vector

注：*表示差異顯著(P<0. 05)，**表示差異極顯著(P<0. 01)

3 討論

昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要是由保幼激素(Juvenile hormone，JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone hormone，20E)協(xié)同調(diào)控.(Methoprene tolerant，Met)作為JH的受體，可通過招募一些共激活因子與20E受體復(fù)合物EcR-USP結(jié)合來調(diào)控20E誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，從而在家蠶由幼蟲到蛹期的變態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用[32].最新研究表明，家蠶的E93蛋白中的兩個(gè)HTH結(jié)構(gòu)域能參與誘導(dǎo)20E的靶基因表達(dá)，從而使Bombyx E93在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)蛻皮激素促進(jìn)的家蠶變態(tài)發(fā)育發(fā)揮正調(diào)控作用[33].

本研究對(duì)絲腺高表達(dá)的ncRNA Bm-152在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的功能進(jìn)行深入探索，發(fā)現(xiàn)Bm-152在吐絲第1天出現(xiàn)明顯過表達(dá)，到預(yù)蛹期后表達(dá)量又下調(diào)，表明其可能在絲蛋白合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用.同時(shí)為了進(jìn)一步探索Bm-152可能的功能，我們檢測(cè)了注射2 μg劑量piggyBac [A3-EGFP-A3-Bm-152]過表達(dá)載體后，家蠶非絲腺組織中蛻皮激素和保幼激素信號(hào)通路基因的表達(dá)變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素信號(hào)通路基因 Usp和E75A分別明顯上調(diào)1.95倍和2.26倍，保幼激素信號(hào)通路基因Met也上調(diào)1.79倍.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bm-152與Usp、E75A和Met無明顯的序列互補(bǔ)區(qū)域，可能不是通過直接結(jié)合在激素信號(hào)通路基因的DNA序列上發(fā)揮作用.但在前期研究中我們也發(fā)現(xiàn)Bm-152作可結(jié)合在核蛋白復(fù)合體上[16,31]，表明Bm-152可能通過與蛋白的互作參與蛻皮激素和保幼激素信號(hào)通路基因的表達(dá)調(diào)控.但是具體機(jī)制如何，是否直接作用在信號(hào)通路相關(guān)基因上還需進(jìn)一步研究.

該結(jié)果為進(jìn)一步探索Bm-152功能提供了方向，為研究ncRNA參與昆蟲的變態(tài)發(fā)育調(diào)控提供更多可以借鑒的依據(jù).