胡 蘭，隋世慧，吳 丹

（沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 沈陽110866）

肌肉生成抑制素基因（myostatin，MSTN）是1997年美國的John Hopkins大學醫(yī)學院的一個研究小組在研究轉化生長因子－β（TGF－β）時發(fā)現(xiàn)的一類生長因子，被命名為生長/分化因子－8（GDF－8）。由于GDF－8是一種能夠對肌肉生長起負調控作用的分泌蛋白，所以又命名為肌肉生成抑制素。McPherron研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因缺失鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更廣泛，體重約是野生鼠的2倍［2］。Kambadur發(fā)現(xiàn)，雙肌牛中該基因發(fā)生突變，結果在同樣喂食條件下，雙肌牛比普通牛多提供30% 的肉產品，極大地提高了飼料轉化效率［3］。

MSTN基因主要通過抑制成肌細胞的增殖與分化促進肌肉的生長［4］，任何能夠抑制其表達的方法都會影響到動物體肌肉的生成。2002年，Lin J等建立了 MSTN基因敲除鼠模型［5］，2010年，Jain H等報道了利用RNA干擾法完成了羊成纖維細胞MSTN基因缺失模型的建立［6］。

本試驗旨在根據(jù)RNA干擾基因表達的原理，構建高效抑制MSTN基因表達的RNAi雙元表達載體，建立非基因水平上的 MSTN“Konck－out”模型，從而為進一步研究該基因的作用機理、有效控制畜禽肌肉生長，以及治療肌營養(yǎng)不良等疾病提供重要的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 制備雞原代成肌細胞時取材于El4海藍雞雞胚（雌雄不限），雞胚由沈陽農業(yè)大學種雞場提供。

1.1.2 菌株和質粒 工程菌株 DH5α、scs110、質粒pHANNIBAL、質粒pEGFP－N1均為本實驗室保存產品；TA克隆載體pMD－18Tsimple vector，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 工具酶和主要試劑 Western blotting試劑盒、限制性內切酶和DNA Ladder Marker等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；一抗為GDF－8，購自SCBT公司；二抗為HRP－兔抗羊IgG，購自北京華特生生物公司。

1.1.4 引物 引物一：上游5′－CTCGAGCTGGCAGAGTATTGATGTG－3′（引入XhoⅠ酶切位點）；

下 游 5′－GGTACCCTGGGATTTGCTTTGT－GT－3′（引入KpnⅠ酶切位點）；

引 物 二：上 游 5′－GGATCCCTGGCAGAGTATTGATGTG－3′（引入BamHⅠ酶切位點）；

下 游 5′－ATCGATCTGGGATTTGCTTTGTGT－3′（引入ClaⅠ酶切位點）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的PCR擴增 反應條件如下：94℃預變性2min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10min，將PCR產物分別命名為M1和M2。

1.2.2 TA克隆 PCR產物經電泳、克隆、測序，將鑒定正確的克隆命名為p－M1和p－M2。

1.2.3 目的片段的亞克隆 雙酶切pHANNIBAL、p－M1和p－M2，電泳回收、酶切鑒定、連接，將已插入正向和反向目的片段的中間載體命名為pHA－M1－M2。

1.2.4 MSTN RNAi雙元表達載體的構建 用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pHA－M1－M2和pEGFPN1，電泳回收相應的目的片段，連接，轉化，卡那抗性篩選、提取質粒，單、雙酶切鑒定。

1.2.5 成肌細胞培養(yǎng) 常規(guī)方法培養(yǎng)14日齡鴨胚成肌細胞，轉染1h后，再加入完全培養(yǎng)基至5mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.6 轉染細胞中MSTN蛋白表達檢測 轉染后48h，SDS－PAGE電泳分離蛋白，蛋白質轉移到PVDF膜，30mA恒流過夜，封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5h，加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，經X膠片曝光顯影。

2 結果與分析

2.1 MSTN RNAi雙元表達載體目的片段的獲得以MSTN cDNA為模版，PCR擴增產物電泳圖（圖1）可見清晰條帶，分別命名為 M1和 M2。M1和M2克隆后經單、雙酶切（圖2）鑒定，序列測定結果與預期片段相符。

圖1 PCR擴增產物電泳

為了獲得構建MSTN RNAi雙元表達載體所需的目的片段，分別利用KpnⅠ和XhoⅠ對p－M1單、雙酶切，分別利用ClaⅠ和BamHⅠ對p－M2單、雙酶切，電泳結果（圖3）與預期完全一致。回收兩個雙酶切片段。

2.2 目的片段亞克隆的鑒定結果 試驗中以pHANNIBAL為中間載體，將XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切回收的片段正向插入pHANNIBAL，經回收、電泳鑒定（圖4）為陽性的質粒命名為pHA－M1；然后將經ClaⅠ/BamHⅠ雙酶切回收的片段反向插入質粒pHA－M1，電泳鑒定（圖5）為陽性的質粒命名為目的序列并命名為pHA－M1－M2。

圖5 pHA－M1－M2經XhoI和BamHI的單、雙切電泳圖

2.3 MSTN RNAi雙元表達載體pEGFP－N1－M1－M2的構建 用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切重組質粒pHA－M1－M2和表達載體pGEFP－N1，連接、轉化、培養(yǎng)、提質粒后對重組質粒進行單、雙酶切鑒定（圖6），雙酶切后電泳檢測出現(xiàn)了4.7kb和1.5kb左右的兩個片段，結果與設計一致。借助中間載體的幾次亞克隆，成功構建了含有MSTN－RNAi表達盒的雙元表達載體pEGFP－N1－M1－M2（圖7）。

圖6 pEGFP－N1－M1－M2 酶切鑒定電泳圖

2.4 熒光蛋白的表達檢測 將已構建的pEGFPN1－M1－M重組質粒轉染成肌細胞，48h后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有綠色熒光如（圖8），說明成功轉染。

2.5 pEGFP－N1－M1－M 對 MSTN 蛋白表達的影響 轉染48h后，SDS－PAGE蛋白電泳結果（圖9）顯示對照組Ⅰ（空白組）和對照組Ⅱ（空載體組）在42kD處有一明顯蛋白條帶，而試驗組在42kD處幾乎看不見有蛋白條帶。Western blot對成肌細胞MSTN蛋白表達結果（圖10）表明，pEGFP－N1－M1－M2轉染48h后，能夠明顯抑制成肌細胞中MSTN基因的表達。

3 討論

本試驗以TA載體為克隆載體，pHANNIBAL為中間載體，表達載體選用了pEGFP－N1－M1－M2。pHANNIBAL是含有丙酮酸磷酸激酶（PDK）內含子序列的亞克隆載體，在內含子的兩側各有一個多克隆位點，該中間載體內含子邊界序列在形成發(fā)夾RNA（hpRNA）結構中十分關鍵，也是產生RNAi的關鍵所在［7］。將目的片段從TA克隆載體上切下后，以正、反兩個方向插到中間載體上，經表達能夠形成完整的發(fā)夾結構。該發(fā)夾結構在Dicer酶的作用下被切成長度在19～22nt的siRNA雙鏈，siRNA雙鏈產生后，siRNA結合到核糖核酸酶復合物上被切割成具有同源序列的基因轉錄體，最終導致基因沉默效應［8］。

pEGFP－N1－M1－M2轉染成肌細胞48h后，可檢測到綠色熒光蛋白表達，該雙元表達載體可明顯抑制成肌細胞MSTN基因的表達。該試驗為有效抑制成肌細胞MSTN基因的表達提供了一條新的途徑。但是，該雙元表達載體是否對動物體其他細胞的蛋白生成有影響，如何將其應用于畜牧生產或者某些疾病的臨床治療等諸多問題還有待進一步研究。

［1］ Lee S J，Mcpherron A C.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF－beta superfamily member［J］.Nature，1997，387：83－90.

［2］ Mcpherron A C，Lee S J.Suppression of body fat accumulation in myostatin deficient mice［J］.Clin intrest，1997，109（5）：595－601.

［3］ Kambadur R，Sharma M，Smith T P，etal.Mutations in myostatin in double－muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle［J］.Genome Res，1997，7（9）：910－916.

［4］ Joulia－Ekaza D，Cabello G.Myostatin regulation of muscle development：Molecular basis，natural mutations，physiopathological aspects［J］.Experimental Cell Research，2006，312（13）：2401－2414.

［5］ Lin J，Arnold HB，Della－Fera MA，etal.Myostatin knockout in mice increases myogenesis and decreases adipogenesis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，291（3）：701－706.

［6］ Jain H，Singh S，Kadam M，etal.Knockdown of the myostatin gene by RNA interference in caprine fibroblast cells［J］.J Biotechnol，2010，145（2）：99－102.

［7］ Helterline D L，Garikipati D，Stenkamp D L，etal.Embryonic and tissue－specific regulation of myostatin－1and－2gene expression in zebrafish［J］.Gen Comp Endocrinol，2011，151（1）：90－97.

［8］ Hamada M，Ohtsuka T，Kawaida R，etal.Effects on RNA interference in gene expression（RNAi）in cuLtured mammalian cells of mismatches and the introduction of chemical modifications at the 3’－ends of siRNAs［J］.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2002，12：301－309.