盧 超，趙壽經(jīng),，張曉佳，杜芃川，王雪松,

(1.吉林大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，長春 130022；2.吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長春 130012)

0 引 言

人參和西洋參是重要的傳統(tǒng)中藥材，人參皂苷是人參屬植物主要的藥理活性成分[1,2]。與西洋參相比，人參根部的Rg1/Rd比值較高，這是傳統(tǒng)中醫(yī)理論人參“性溫”而西洋參“性涼”的現(xiàn)代分子基礎(chǔ)[3,4]。原人參二醇型皂苷以人參皂苷Rd為代表，主要通過催化原人參二醇的C3和C20號位羥基的糖基化形成；原人參三醇型皂苷以人參皂苷Rg1為代表，主要通過催化原人參三醇的C6和C20號位羥基的糖基化形成[5,6]。

原人參二醇3號位葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(Pg3-O-UGT1)可催化原人參二醇形成人參皂苷Rh2，是二醇型皂苷合成過程的關(guān)鍵酶基因。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)抑制人參中Pg3-O-UGT1基因的表達(dá)，可使代謝能量主要流向三醇型皂苷合成支路；在改善人參藥理活性的同時為人參皂苷合成途徑的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)[7,8]。

本文利用酶切連接技術(shù)，通過克隆載體構(gòu)建了人參3-O-UGT1基因的植物表達(dá)載體工程菌(A4-pBI121-3UGT1-RNAi)，為研究人參皂苷體內(nèi)合成機(jī)制和種質(zhì)創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)，也為傳統(tǒng)名貴中藥材的研究提供了素材。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人參發(fā)根材料和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)A4為本實(shí)驗(yàn)室保存;感受態(tài)大腸桿菌JM109、pMD20-T載體、pBI121植物雙元表達(dá)載體、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶以及各種限制性內(nèi)切酶等，均購于寶生物工程(大連)有限公司；卡那霉素購自于北京鼎國生物制品有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 RNA干擾元件核心片段的獲得

由GenBank得到原人參二醇3號位葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(Pg3-O-UGT1；JX898529)序列，通過Clustal X軟件將其核酸序列與其他物種糖基轉(zhuǎn)移酶基因(西洋參GT, KR028477; 黃瓜GT, XM004136988; 甜瓜GT, XM008457048)對比確定其保守區(qū)域。再與人參中原人參二醇合成酶基因(人參D12H, JN604536)、原人參三醇合成酶基因(人參P6H, JX036031)、人參皂苷3號位葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶2基因(人參GT2, JX898530)對比確定干擾區(qū)域不會影響其他相關(guān)基因的正常表達(dá)。用軟件 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)核心片段的特異性引物：P1, 5′- AGA GGA AAA AGG CCT AAT AGT GAG T-3′；P2, 5′-ACT CAT CAA TAT TCT TAT CAG AGC T-3′。

以MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周的人參發(fā)根為實(shí)驗(yàn)材料，用植物總RNA提取試劑盒提取人參總RNA。以總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR，獲得人參cDNA。以人參cDNA為模板進(jìn)行核心片段的PCR擴(kuò)增，將純化后的PCR產(chǎn)物按比例與pMD20-T載體進(jìn)行TA克隆連接，采用熱轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-GT。

2.2 RNA干擾元件的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pMD-GT為模板，以P3(在P1的5′端添加XbaⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)和P4(在P2的5′端添加BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)為引物擴(kuò)增正義片段，PCR程序與擴(kuò)增核心片段相同；以重組質(zhì)粒pMD-GT為模板，以P5(在P2的5′端添加SmaⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)和P6(在P1的5’端添加SacⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)為模板擴(kuò)增反義片段，PCR程序與上相同。使用XbaⅠ/BamH Ⅰ限制酶對重組質(zhì)粒pMD-GT和正義片段同時雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將測序驗(yàn)證后的重組載體命名為pMD-S；使用SmaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質(zhì)粒pMD-S和反義片段同時雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，采用熱轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證后的重組載體命名為pMD-3UGT1-RNAi(3種重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示)。

圖1 三種重組載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of three recombinant vectors

2.3 RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

使用XbaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質(zhì)粒pMD-3UGT1-RNAi和表達(dá)載體pBI121同時雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，采用熱轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證后的重組載體命名為pBI121-3UGT1-RNAi。采用熱轉(zhuǎn)化法將重組載體pBI121-3UGT1-RNAi轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取Ri質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA干擾元件核心片段的擴(kuò)增

相關(guān)基因的核酸序列對比結(jié)果如圖2和3所示。在所示圖中，序列上方的黑點(diǎn)越密集就表示該區(qū)域保守性越高，反之亦然。

圖2 不同植物GT基因序列對比圖Fig. 2 Comparison of GT sequences in different plants

圖3 人參中相關(guān)基因序列對比圖Fig. 3 Comparison of relative gene sequences inPanax ginseng

在圖2中，所選取的Pg3-O-UGT1基因片段與西洋參、甜瓜、黃瓜的糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)基因相比較具有較高的保守性，可以確定該核酸片段為Pg3-O-UGT1基因核心片段。在圖3中，擬干擾的核心片段與人參中其他影響皂苷合成的基因相似性很低。因此，干擾所選取的目的基因不會影響其他與皂苷合成的相關(guān)基因的正常表達(dá)。

人參發(fā)根總RNA的電泳結(jié)果如圖4所示。在圖4的 1～3泳道中28S rRNA和18S rRNA的特征條帶清晰，且28S rRNA和18S rRNA條帶的亮度和寬度比例大約為2∶1。電泳結(jié)果證明所提總RNA比較完整，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。

圖4 人參總RNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis of total RNA from Panax ginseng

以人參發(fā)根總RNA發(fā)轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以P1/P2為引物擴(kuò)增核心片段。核心片段的電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 5 Electrophoresis of the RT-PCR products

在圖5中，1-4泳道在380bp左右處有清晰條帶，將該條帶純化回收后與pMD20-T載體連接，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。將陽性克隆菌送至北京金維智公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與GenBank已發(fā)表的糖基轉(zhuǎn)移酶序列一致。將經(jīng)驗(yàn)證的該重組質(zhì)粒命名為pMD-GT。

3.2 RNA干擾元件的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pMD-GT為模板，以P3/P4為引物擴(kuò)增正義片段。用XbaⅠ/BamHⅠ限制酶對純化后的正義片段與重組質(zhì)粒pMD-GT同時雙酶切，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。提取陽性克隆菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證，雙酶切結(jié)果如圖6所示。

在圖6中，1泳道2730bp和380bp大小條帶分別是經(jīng)酶切后的pMD20-T載體片段和正義片段。將驗(yàn)證后的重組載體命名為pMD-S。

以重組質(zhì)粒pMD-GT為模板，以P5/P6為引物擴(kuò)增反義片段。用SmaⅠ/SacⅠ限制酶對純化后的反義片段與重組質(zhì)粒pMD-S同時雙酶切，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。提取陽性克隆菌質(zhì)粒用XbaⅠ/SacⅠ限制酶進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證，雙酶切結(jié)果如圖7所示。

圖6 pMD-S克隆載體的雙酶切鑒定Fig.6 Double enzyme digestion of pMD-S vector

圖7 pMD-3UGT1-RNAi克隆載體的雙酶切鑒定Fig. 7 Double enzyme digestion ofpMD-3UGT1-RNAi vector

在圖7中，1泳道2730bp和780bp大小條帶分別是經(jīng)酶切后的pMD20-T載體片段和構(gòu)建好的RNAi干擾元件。將驗(yàn)證后的重組載體命名為pMD-3UGT1-RNAi。

3.3 RNA表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

使用XbaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質(zhì)粒pMD-3UGT1-RNAi和表達(dá)載體pBI121同時雙酶切，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。提取陽性克隆菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切結(jié)果如圖8所示。

在圖8中，1泳道13600bp和780bp大小條帶分別是經(jīng)酶切后的pBI121載體片段和構(gòu)建好的RNAi干擾元件。電泳結(jié)果與預(yù)期一致，說明表達(dá)載體pBI121-3UGT1-RNAi構(gòu)建成功。

圖8 pBI121-3UGT-RNAi表達(dá)載體的雙酶切鑒定Fig.8 Double enzyme digestion of expressionvector pBI121-3UGT1-RNAi

用熱轉(zhuǎn)化法[9]將重組載體pBI121-3UGT1-RNAi轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后，挑取陽性克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)。提取陽性克隆菌的Ri質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，以Ri質(zhì)粒為模板，P1/P2為引物。電泳結(jié)果如圖9所示。

圖9 質(zhì)粒PCR電泳圖Fig.9 Electrophoresis of the plasmid PCR products

在圖9中，兩泳道在380bp左右處有清晰條帶，表明RNAi植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌A4中。將該工程菌命名為A4-pBI121-3UGT1-RNAi，甘油冷凍保存。

4 結(jié)束語

RNAi技術(shù)在鑒定功能基因和次級代謝產(chǎn)物合成的研究方面一直有著廣泛的應(yīng)用。本文利用酶切連接技術(shù)，通過pMD20-T載體的高效利用，成功構(gòu)建原人參二醇3號位葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶1基因(Pg3-O-UGT1)RNAi植物表達(dá)載體，并構(gòu)建了相應(yīng)的植物表達(dá)載體工程菌A4-pBI121-3UGT1-RNAi。與一般構(gòu)建方法相比，既避免了PCR條件的反復(fù)摸索，又能夠保證驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，材料廉價易得，適應(yīng)性廣。

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