楊遠超，何芳，劉學偉，溫彬宇，閆妍，唐旭，高俊峰，王新祥

（1.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078）

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊或蔓荊的干燥成熟果實，在我國最早的藥學專著《神農本草經》列為上品，記載有“主筋骨間寒熱，濕痹拘攣，明目，堅齒，利九竅，去白蟲”。蔓荊子為臨床常用中藥，其性寒、味辛苦，入肝、胃、膀胱經，具有疏散風熱、清利頭目的功效，用于治療風熱感冒頭痛、齒齦腫痛、目赤多淚、目暗不明及頭暈目眩等癥[1]。有研究表明，蔓荊子具有鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、抗菌、祛痰和抗腫瘤等作用[2-3]。主要成分含揮發(fā)油、微量生物堿、維生素A、蔓荊子黃素、蔓荊子堿及γ-氨基丁酸等[4-5]。其中，蔓荊子黃素被認為是主要有效成分之一，藥典規(guī)定不得低于0.030%要求，一般含有量在0.027%～0.139%之間[6]。

蔓荊子黃素（Vitexicarpin），又稱為紫花牡荊素（Casticin），屬于多甲氧基黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抑制炎癥反應和免疫抑制等[7]多方面的藥理作用。近年來在抗腫瘤作用方面，有研究顯示蔓荊子黃素對乳腺癌、肺癌、宮頸癌、肝癌及胃癌等[8-12]多種腫瘤細胞有較強的增殖抑制活性，有可能作為植物來源的抗腫瘤候選藥物。另外，其免疫調節(jié)作用也較早受到關注。YOU等[13]最早報道，蔓荊子黃素能夠有效抑制小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖。MESAIK等[14]研究發(fā)現，蔓荊子黃素能夠對單核細胞的氧化裂解產生顯著的抑制作用，對嗜中性粒細胞的趨化性和植物凝血素刺激的T淋巴細胞也顯示抑制作用。林珊等[15]采用乙酸誘導的小鼠腹膜毛細血管通透性增加的模型，發(fā)現蔓荊子黃素具有明顯的體內抗炎作用。王紅英等[16]研究發(fā)現，紫花牡荊素可能通過調節(jié)細胞因子改善佐劑性關節(jié)炎小鼠足跖腫脹度。上述研究顯示，蔓荊子黃素治療炎癥或免疫調節(jié)性疾病可能有良好應用前景，然而目前為止，對屬于免疫細胞的單核/巨噬細胞作用的研究未見任何報道。本研究通過對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞活性以及對單核巨噬細胞RAW264.7的細胞增殖、凋亡的研究，來揭示蔓荊子黃素對免疫的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 ICR小鼠2只，雄性，8～10周齡，體重30～40 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；RAW264.7小鼠單核巨噬細胞株由北京中醫(yī)藥大學生命科學學院郝鈺教授饋贈，DMEM培養(yǎng)基為Hy Clone公司產品，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶消化液（0.25%trypsin-EDTA）均為Gibco公司產品，蔓荊子黃素（vitexicarpin）購自上海源葉生物科技有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、無水乙醇（ethanol）購自國藥集團化學試劑有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）購自 Solarbio公司，CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司，活性氧（reactive oxygen species,ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，碘化丙啶（propidium iodide, PI）、溴化乙錠（ethidium bromide, EB）為Sigma公司產品，吖啶橙（acridine orange, AO）購自欣經科生物技術有限公司，JC-1購自Fluka公司，0.4%臺盼藍染液購自Solarbio公司。

1.1.2 實驗儀器 二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），移液器（德國Eppendorf公司）（型號為2.5、20.0、200.0及1 000.0 μl），超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司），倒置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司IX71），酶聯免疫檢測儀（Bio Tek公司ELX800），全功能酶標儀（Bio Tek公司 Synergy H1），高速低溫離心機（德國Eppendorf公司，Centrifuge 5424R），低速離心機（北京白洋淀醫(yī)療器械有限公司，320C），流式細胞儀（美國BD公司FACSCanto Ⅱ）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞體外分離與培養(yǎng) 隨機選取2只ICR小鼠，腹腔注射不含血清培養(yǎng)基5 ml，輕柔小鼠腹部2～3 min，使液體在腹腔內充分流動，靜置5～7 min后將小鼠頸椎脫臼處死，置于解剖板上，無菌條件下打開腹腔，用眼科鑷提起下腹皮膚，剪1個小口，并沿腹中線剪開3～5 cm的腹部皮膚，充分暴露腹膜，剪開腹部皮膚后在肌肉層剪1個小口，用吸管吸取腹腔灌洗液，并重復灌洗1次。

將2次收集的腹腔灌洗液轉至15 ml離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清，用PBS洗滌2遍。加入DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FBS、0.1%青鏈霉素溶液），用細胞計數板計數，顯微鏡下（×100）計數巨噬細胞。用DMEM完全培養(yǎng)基調節(jié)細胞數至2×106個/ml，接種于培養(yǎng)瓶及96孔板，放入37℃、5% CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使巨噬細胞充分貼壁。孵育4 h后，去上清，用DMEM培養(yǎng)基洗滌1、2次，去除非黏附的其他細胞，獲得的貼壁細胞即為單層的巨噬細胞，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。另取巨噬細胞懸液0.9 ml于1.5 ml離心管中，加入0.1 ml 0.4%臺盼藍染液（終濃度為0.04%），混勻，靜置2～3 min后，取1滴染色的細胞懸液滴加入計數板中，置于顯微鏡下觀察，分別計數死細胞、活細胞，計算活細胞占計數細胞的百分率，顯示巨噬細胞的成活率達95%以上。

1.2.2 RAW264.7細胞的培養(yǎng) RAW264.7細胞為小鼠源巨噬細胞，培養(yǎng)在含10% FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3天傳代1次。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 細胞活性檢測 按照CCK-8試劑盒說明書提供的方法，分別測定蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞及RAW264.7細胞的增殖抑制作用。

將小鼠原代分離的腹腔巨噬細胞，以細胞數1×105個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、含5%CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0、1、5、10及50 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用24、48和72 h，每個濃度設置4個復孔，同時設空白組（只含有等量培養(yǎng)基）和對照組（含同數量細胞和等量培養(yǎng)基），每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，使用EXL-800酶聯免疫檢測儀在450 nm波長測定細胞樣品的光密度（optical density,OD）。

取對數生長期RAW264.7細胞，以細胞數1×105個/ml接種于96孔板，100 μl/孔，置于37℃、含5%CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將蔓荊子黃素配制的溶液（DMSO濃度＜0.15%），分別設定0.0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0及10.0 μmol/L不同濃度，每個濃度設4個復孔，同時設空白組（只含有等量培養(yǎng)基）和對照組（含同數量細胞和等量培養(yǎng)基），加藥后分別將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)2 h，使用EXL-800酶聯免疫檢測儀在450 nm波長測定細胞樣品的OD值。

按如下公式計算細胞活性：細胞活性（%）=[OD（加藥）-OD（空白）]/[OD（對照）-OD（空白）]×100%，計算細胞存活率；數據分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計算抑制細胞生長達50%的各藥物濃度，即半數抑制濃度，以IC50值（50% inhibitory concentration）表示。相同實驗重復3遍，計算平均值及標準差。繪制時間-存活率折線圖。

1.2.4 RAW264.7細胞核AO/EB雙染觀察細胞凋亡 取對數生長期RAW264.7細胞，以細胞數1×105個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待其貼壁后，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用細胞48 h，每個濃度設置4個復孔，依次加入AO染色液（終濃度為5 μg/ml）及EB染色液（終濃度為10 μg/ml），4℃避光孵育20 min后，用PBS洗滌2次。使用藍光熒光激發(fā)的濾光片，在倒置熒光相差顯微鏡下觀察細胞核的染色情況并拍照。實驗重復3次。

1.2.5 RAW264.7細胞凋亡率檢測 取對數生長期RAW264.7細胞，以細胞數2.5×105個/ml接種于6孔板，每孔2 ml，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)待貼壁，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用細胞48 h后，胰酶消化后收集細胞，1 000 r/min離心10 min，去上清液，預冷PBS洗2次，制成單細胞懸液，離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃放置8 h以上，取出固定的樣品，2 000 r/min離心10 min，去上清液，加入1 ml預冷PBS重懸細胞，離心后去上清收集細胞；加入PI染液（終濃度為150 μg/ml）染色，4℃避光染色30 min，400目篩網過濾1次，進行流式細胞儀檢測。實驗重復3次，計算平均值及標準差。

1.2.6 RAW264.7細胞活性氧含量檢測 取對數生長期RAW264.7細胞，以細胞數1×106個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)待貼壁。然后用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用細胞2 h，每個濃度設置4個復孔，并設置空白對照組、陽性對照組。去除細胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μl用無血清培養(yǎng)液稀釋的2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（終濃度為10 μmol/L），陽性對照組加入Rosup（終濃度為10 μmol/L），37℃孵育20 min后去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次。按照活性氧（ROS）檢測試劑盒說明書提供的方法，在倒置熒光相差顯微鏡下觀察并拍照，使用全功能酶標儀檢測熒光值，激發(fā)波長設置為488 nm，發(fā)射波長設置為525 nm。實驗重復3次，計算平均值及標準差。

1.2.7 RAW264.7細胞線粒體膜電位的檢測 取對數生長期RAW264.7細胞，以細胞數1×105個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基分別作用細胞24、48和72 h，每個濃度設置4個復孔。去除細胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μl JC-1染色液（終濃度為5 μg/ml），37℃培養(yǎng)20 min后去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次。倒置熒光相差顯微鏡下觀察并拍照，全功能酶標儀檢測熒光值，檢測JC-1單體時激發(fā)波長設置為488 nm，發(fā)射波長設置為530 nm；檢測JC-1聚合物時，激發(fā)波長設置為529 nm，發(fā)射波長設置為590 nm。實驗重復3次，計算平均值及標準差。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較使用單因素或重復測量設計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響

各組經藥物作用不同時間后小鼠腹腔巨噬細胞存活率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間的各組細胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=20.590，P=0.000），②各組細胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.679，P=0.012），50μmol/L蔓荊子黃素劑量組與0.0、1.0、5.0及10.0μmol/L劑量組比較，抑制作用較強，③各組細胞的存活率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.352，P=0.000）。見表1。

藥物作用24和48 h時，各濃度蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞未表現出抑制作用；藥物作用至72 h，各濃度的蔓荊子黃素均對小鼠腹腔巨噬細胞表現出不同程度的抑制作用，呈明顯的量效依存性，與0.0 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中，50 μmol/L濃度的抑制作用最強，達26.4%。

表1 蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響（n =4，±s）

表1 蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響（n =4，±s）

蔓荊子黃素濃度OD值24 h 48 h 72 h 0.0 μmol/L 0.358±0.004 0.381±0.019 0.463±0.006 1.0 μmol/L 0.354±0.003 0.388±0.017 0.430±0.006 5.0 μmol/L 0.367±0.015 0.419±0.033 0.420±0.027 10.0 μmol/L 0.352±0.008 0.389±0.034 0.394±0.019 50.0 μmol/L 0.339±0.017 0.374±0.012 0.341±0.017

2.2 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞活性的影響

各組經藥物作用不同時間后RAW264.7細胞存活率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間的各組細胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=37.154，P=0.000）。②各組細胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=296.736，P=0.000），2、5及10 μmol/L蔓荊子黃素劑量組與0.0、0.1、0.5及1.0 μmol/L劑量組比較，抑制作用較強。③各組細胞的存活率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=27.738，P=0.000）。見表 2。

藥物作用結果顯示，與0.0μmol/L組比較，5.0和10.0 μmol/L蔓荊子黃素劑量組在作用24、48和72 h時，對細胞的抑制作用均呈現量效依存性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。24、48 和 72h 的 IC50分別為 6.202、2.628及 3.064μmol/L。

表2 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞活性的影響（n =4，±s）

表2 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞活性的影響（n =4，±s）

蔓荊子黃素濃度OD值24 h 48 h 72 h 0.0 μmol/L 0.767±0.061 0.885±0.041 0.864±0.034 0.1 μmol/L 0.782±0.039 0.871±0.038 0.818±0.054 0.5 μmol/L 0.794±0.139 0.865±0.017 0.841±0.109 1.0 μmol/L 0.800±0.035 0.802±0.117 0.799±0.129 2.0 μmol/L 0.655±0.084 0.702±0.050 0.795±0.032 5.0 μmol/L 0.382±0.008 0.095±0.006 0.131±0.028 10.0 μmol/L 0.296±0.018 0.044±0.009 0.024±0.003

2.3 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞核的影響

0.0μmol/L組大部分細胞大小、形態(tài)較均一，細胞呈現均勻的綠色熒光，為正常未發(fā)生凋亡的RAW264.7細胞（見圖1）；RAW264.7細胞經濃度為5.0及10.0 μmol/L的蔓荊子黃素處理48 h后細胞體積變小，結構模糊，大部分細胞的細胞質減少、細胞核染色質固縮偏向一邊或碎裂，呈橘黃色或紅色熒光，顯示為凋亡的形態(tài)，并可見細胞碎片，及少量未發(fā)生凋亡的細胞和壞死細胞（見圖1D、E）。

圖1 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞核染色的影響 （48 h，AO/EB雙染×200）

2.4 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，隨著蔓荊子黃素濃度增加，RAW264.7細胞出現不同的二倍體峰（Sub-G1峰、凋亡峰），根據此峰的面積得出不同凋亡細胞的百分率，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=7.929，P=0.014）。0.1及1.0 μmol/L組細胞的凋亡率與0.0 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。5.0及10.0 μmol/L組細胞的凋亡率高于0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞凋亡率的影響（48 h）

圖3 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞凋亡率的影響（n =4，±s）

2.5 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞內活性氧水平的影響

以0.0 μmol/L組熒光強度值為1（即100%），計算不同濃度的蔓荊子黃素組、陽性組與0.0 μmol/L組的比率。在藥物處理2 h時，隨著蔓荊子黃素濃度的增加，RAW264.7細胞內活性氧（ROS）水平逐漸增加。不同組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=3.190，P=0.024）。0.1和1.0 μmol/L組細胞中活性氧表達水平與0.0 μmol/L比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。5及10 μmol/L組細胞內活性氧表達水平高于0.0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4、5。

圖4 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞活性氧水平的影響（n =4，±s）

圖5 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞活性氧的影響 （2 h，DCFH-DA探針，×100）

2.6 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞線粒體內膜電位的影響

正常線粒體內，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光（Ex=585 nm，Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產生綠色熒光（Ex=514 nm，Em=529 nm）。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的1個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。通過計算紅/綠熒光強度的相對比率可以衡量線粒體去極化的比例。

結果顯示，各組經藥物作用不同時間的細胞紅/綠熒光強度比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①不同時間的細胞紅/綠熒光強度比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.131，P=0.007）。②各組細胞的紅/綠熒光強度比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=47.203，P=0.000），0.0 μmol/L蔓荊子黃素組紅色熒光強，綠色熒光弱，紅/綠熒光強度的相對比例較高，說明大部分細胞的線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常；5.0 及10.0 μmol/L蔓荊子黃素劑量組紅色熒光減弱，綠色熒光增強，紅/綠熒光強度較低，細胞線粒體膜電位較低。說明大部分細胞線粒體膜電位下降，大部分細胞處于細胞凋亡早期，相較于0.0 μmol/L組，5.0、10.0 μmol/L組的RAW264.7細胞凋亡率增加。③各組細胞的紅/綠熒光強度變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.649，P=0.017）。見圖6和表3。

圖6 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響 （48 h，JC-1染色，×200）

表3 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響（n =4，±s）

表3 蔓荊子黃素對RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響（n =4，±s）

蔓荊子黃素濃度紅/綠熒光強度的比值24 h 48 h 72 h 0.0 μmol/L 1.851±0.159 2.877±0.246 1.271±0.104 0.1 μmol/L 1.908±0.439 2.852±0.310 1.344±0.186 1.0 μmol/L 1.904±0.105 2.826±0.312 1.136±0.176 5.0 μmol/L 1.120±0.182 1.057±0.185 0.742±0.102 10.0 μmol/L 1.172±0.126 0.756±0.08 0.502±0.064

3 討論

本研究發(fā)現，蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞與小鼠單核巨噬細胞RAW264.7的細胞活性都有抑制作用，尤其對具有增殖能力的RAW264.7細胞活性抑制作用更強，可以促進其凋亡，其作用機制與增加細胞內活性氧水平與降低線粒體膜電位有關。

巨噬細胞是一種位于組織內的免疫細胞，源自血單核細胞。巨噬細胞和單核細胞皆為吞噬細胞，在脊椎動物體內參與非特異性免疫和特異性免疫。巨噬細胞能夠對細胞殘片及病原體進行吞噬及消化，并通過釋放細胞因子等激活免疫系統(tǒng)中的其他細胞，具有免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調節(jié)及抗原呈遞等多種免疫功能，在特異性和非特異性免疫過程中均發(fā)揮著重要的作用。蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞活性實驗顯示，藥物作用至72 h，各個濃度的蔓荊子黃素均對巨噬細胞表現出不同程度的抑制作用，呈量效依存性，其中50.0 μmol/L濃度的抑制作用達26.4%。另外，實驗進一步使用小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞進行研究。RAW264.7細胞因其性質穩(wěn)定、易于培養(yǎng)等而常用作細胞因子、炎癥性疾病及免疫疾病等研究的細胞模型。對RAW264.7細胞活性實驗顯示，不同濃度的蔓荊子黃素處理RAW264.7細胞24 h，與0.0 μmol/L組比較，較高濃度（2.0、5.0及10.0 μmol/L）蔓荊子黃素對RAW264.7細胞活性呈現量效依存的抑制作用，并隨著藥物作用時間延長，作用明顯增強，但48與72 h無差異；24、48及72 h的IC50分別為6.202、2.628及3.064 μmol/L，72 h的IC50的值＜48 h的IC50值可能是因為隨著時間增長，蔓荊子黃素作用于細胞的效應經過高峰值后開始減弱。蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細胞與RAW264.7細胞的細胞活性都有抑制作用，然而抑制濃度有較大差異，與增殖活躍的RAW264.7的IC50為6.2 μmol/L以下比較，對分化終端而沒有增殖能力的小鼠腹腔巨噬細胞的IC50雖未能確定，但從50.0 μmol/L時抑制率為26.4 %來看，說明增殖活躍的細胞對蔓荊子黃素更為敏感。

細胞凋亡是多種基因調控、有序的死亡過程，是細胞在生理或病理條件下的一種主動死亡方式，早期以DNA降解為特征，最終細胞分解成凋亡小體后被巨噬細胞吞噬降解。實驗顯示蔓荊子黃素能夠抑制單核巨噬細胞RAW264.7的細胞活性，與其促進細胞凋亡有關。RAW264.7細胞經過AO/EB雙染后，在熒光顯微鏡下觀察到RAW264.7細胞經濃度為5.0及10.0 μmol/L的蔓荊子黃素處理后，體積變小，結構模糊，大部分細胞的細胞質減少、細胞核染色質固縮偏向一邊或碎裂，呈橘黃色或紅色熒光，顯示為凋亡的形態(tài)，并可見細胞碎片。另外，RAW 264.7細胞經PI染色后通過流式細胞儀檢測細胞周期的結果顯示，蔓荊子黃素劑量依賴地增加RAW264.7細胞Sub-G1期代表凋亡細胞的比例。

有研究顯示，活性氧（ROS）可以通過對生物膜與蛋白質或DNA的氧化損傷、影響信號轉導和基因表達等來誘導細胞凋亡[17]。由于蔓荊子黃素在化學構造上屬于多甲氧基黃酮類化合物，具有較強的氧化活性，因此實驗細胞內活性氧水平，探討蔓荊子黃素引起RAW264.7細胞凋亡的機制。不同濃度的蔓荊子黃素處理RAW264.7細胞2 h后，熒光顯微鏡觀察隨著藥物濃度的增高，活性氧產生的增強。熒光酶標儀檢定量測定活性氧水平結果顯示，與0.0 μmol/L組比較，隨著藥物濃度的增高，活性氧水平也隨著增加，以較高濃度蔓荊子黃素組（5.0及10.0 μmol/L）的細胞活性氧水平增加最為顯著。

活性氧等許多凋亡誘導劑引起的各種類型的細胞凋亡中均出現線粒體去極化、線粒體膜電位改變引起細胞凋亡[18]。實驗分別用不同濃度的蔓荊子黃素處理RAW264.7細胞24、48及72 h，使用JC-1染色顯示線粒體膜電位，熒光顯微鏡觀察到隨著藥物濃度的增高，線粒體膜電位逐漸下降，尤以作用48 h下降最為顯著；熒光酶標儀定量檢測結果顯示，高濃度蔓荊子黃素（5.0及10.0 μmol/L）的線粒體膜電位下降最為顯著。細胞凋亡過程中線粒體去極化作用增強并且線粒體質量下降，表明該凋亡過程與線粒體途徑密切相關。

近年來，在國外的研究報道中，蔓荊子黃素在抗腫瘤作用方面研究顯示對多種腫瘤細胞有較強的細胞活性抑制與促凋亡作用，通過阻滯細胞有絲分裂紡錘體形成[19-20]、阻滯細胞周期[21-24]、激活相關細胞凋亡的信號通路[25-26]及影響DNA的表達等[27-28]途徑，而對正常細胞未有影響，因此有可能作為植物來源的抗腫瘤候選藥物。在免疫機能的調節(jié)方面，本研究顯示，蔓荊子黃素對小鼠單核巨噬細胞的細胞活性抑制與凋亡促進的實驗結果，結合YOU等[13]與MESAIK等[14]報道的蔓荊子黃素能夠有效抑制小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖研究，初步揭示蔓荊子黃素可能作為免疫調節(jié)劑的應用前景，對其作用與機制的深入研究，可能應用于單核與巨噬細胞增多相關疾病，如傳染性單核細胞增多癥、肉芽腫性疾病、肉狀瘤病、壞死性疾病、發(fā)熱、炎癥疾病或免疫失調性疾病等，并可能為闡明中藥用于發(fā)熱、濕痹等病癥的現代醫(yī)學基礎提供支持與幫助。