黎敏，丁瑞峰，馬曉瑩，劉宇超

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

心血管疾病在全球死因中居首位，全球每年約1.73億人死于心血管疾病[1]。而作為治療心血管疾病的一線用藥氯吡格雷與阿司匹林聯(lián)合雙重抗血小板則在臨床中廣泛應(yīng)用，大量研究已經(jīng)證實(shí)，抗血小板治療在血栓栓塞性疾病一級(jí)和二級(jí)預(yù)防中發(fā)揮重要作用，但在使患者獲益的同時(shí)，其消化道不良事件也日益增多[2]。臨床醫(yī)師對(duì)非甾體抗炎藥引起胃黏膜的損傷研究比較多[3]，氯吡格雷為新型抗血小板藥物，是血小板表面二磷酸腺苷受體拮抗劑，其活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗血小板聚集作用，可抑制血小板釋放具有內(nèi)皮增生和加速修復(fù)潰瘍的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而導(dǎo)致新生血管形成障礙，使胃黏膜修復(fù)受阻[4]，而氯吡格雷是否可以引起小腸黏膜損傷及損傷機(jī)制，目前尚不明確，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，筆者通過(guò)動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)氯吡格雷對(duì)小鼠小腸黏膜的損傷情況，探討其對(duì)小腸黏膜損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及制作動(dòng)物模型

20只無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)6～8周齡BALB/c雄性小鼠（購(gòu)自北京維通利華公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：11400700148334），體重（18±2）g，室溫（20±2）℃，濕度50%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組、氯吡格雷組。氯吡格雷組以氯吡格雷混懸液（按標(biāo)準(zhǔn)體重成人臨床劑量75 mg/d換算成小鼠劑量為11.38 mg/kg）0.5 ml/只，灌胃；空白對(duì)照組以生理鹽水0.5 ml/只，灌胃。均每天1次，連續(xù)2周，造模期間小鼠均正常飲食飲水。

1.1.1 氯吡格雷混懸液的配制 硫酸氯吡格雷（波立維），產(chǎn)自賽諾菲（杭州）制藥有限公司，75 mg/片，用研缽將氯吡格雷片150 mg搗碎備用，按成人臨床劑量75 mg/d（70 kg正常體重）換算成小鼠給藥劑量為為11.38 mg/kg，加生理鹽水配制0.5 ml灌胃，每次灌胃前配制，即用即配。

1.2 采集標(biāo)本

末次灌胃后小鼠禁食不禁水12 h，每只小鼠采用脫頸椎法處死(經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過(guò))，取空腸及回腸組織后，一部分應(yīng)用Reuter評(píng)分進(jìn)行大體評(píng)分，評(píng)估小腸黏膜損傷情況，并固定于10%中性甲醛，余小腸組織置于液氮罐中存放待用。

1.3 Reuter評(píng)分

潰瘍?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：未見明顯損傷為0分，局灶性充血，但未見潰瘍形成為1分，有潰瘍形成，但無(wú)充血及腸管增厚為2分；潰瘍形成伴炎癥反應(yīng)1處為3分；潰瘍形成伴炎癥反應(yīng)2處及以上為4分；穿孔為5分；粘連評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腸管無(wú)粘連為0分；輕度粘連為1分；明顯粘連為2分。損傷總分為潰瘍?cè)u(píng)分和粘連評(píng)分之和。

1.3.1 HE染色 小腸組織置于10%中性甲醛固定6h，低濃度到高濃度酒精梯度脫水，再將組織塊置于透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊中的酒精，浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成4 μm薄片，貼到載玻片上，置于45℃恒溫箱中烘干。經(jīng)由高濃度到低濃度酒精脫蠟，染色，蘇木精水溶液中染色5～10 min，1%鹽酸水及1%氨水中分色5～10 s，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻，入70%和90%酒精中脫水各10 min，入酒精伊紅染色液染色2～3 min。染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，中性樹膠封固。

1.3.2 免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）檢測(cè)小腸黏膜組織中Occludin蛋白的表達(dá) 按以下步驟實(shí)施：取材，固定，脫水浸蠟，包埋，切片，撈片，烤片，脫蠟復(fù)水，微波爐抗原修復(fù)，滴加5% BS封閉液，室溫20 min，滴加適當(dāng)稀釋的一抗，置于4℃冰箱中過(guò)夜，PBS（pH=7.4）洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫20 min，PBS（pH=7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加試劑SABC，室溫20 min，PBS（pH=7.4）洗5 min×4次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，自來(lái)水沖洗，系列酒精梯度脫水，在通風(fēng)櫥中晾干后，中性樹膠封片，顯微拍照。

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%，計(jì)0分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)10%～25%，計(jì)1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)25%～50%，計(jì)2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)50%～75%，計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥75%，計(jì)4分；依據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分，無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃為2分；棕褐色為3分；細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)量和著色強(qiáng)度兩項(xiàng)得分相加：0～1分為陰性；2～3分為弱陽(yáng)性（+）；4～5分為陽(yáng)性（++）；6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；等級(jí)計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腸黏膜大體表現(xiàn)

沿腸系膜對(duì)側(cè)切開小腸，PBS液沖洗干凈，于顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組小鼠小腸黏膜未見明顯損傷，氯吡格雷組見腸管輕度粘連水腫，黏膜點(diǎn)狀糜爛及小潰瘍形成。分析結(jié)果顯示，氯吡格雷組空腸黏膜損傷評(píng)分、回腸黏膜損傷評(píng)分均高于空白對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

表 1 兩組 Reuter評(píng)分比較 （n =10，±s）

表 1 兩組 Reuter評(píng)分比較 （n =10，±s）

組別 空腸黏膜損傷評(píng)分 回腸黏膜損傷評(píng)分空白對(duì)照組 0.000±0.000 0.000±0.000氯吡格雷組 2.000±1.054 1.500±0.707 t值 6.000 6.709

圖1 纖維鏡下小腸黏膜大體表現(xiàn) （×1.6倍）

2.2 小腸黏膜組織學(xué)表現(xiàn)

空白對(duì)照組小腸黏膜層次結(jié)構(gòu)清楚，上皮結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，腺腔內(nèi)整潔，損傷程度為0級(jí)；實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜上皮脫落、壞死，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，評(píng)分越高，代表黏膜損傷程度越重。兩組空腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組回腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2、3 和圖 2。

表2 兩組空腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分比較 [n =10，例（%）]

表3 兩組回腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分比較 [n =10，例（%）]

圖2 各組小鼠小腸黏膜組織學(xué)表現(xiàn) （HE×200）

2.3 兩組Occludin蛋白表達(dá)

Occludin蛋白主要表達(dá)于胞漿，空白對(duì)照組Occludin蛋白的表達(dá)主要呈強(qiáng)陽(yáng)性（+++），陽(yáng)性（++）也有表達(dá)；氯吡格雷組Occludin蛋白表達(dá)主要呈陰性或弱陽(yáng)性（+），提示黏膜上皮損傷嚴(yán)重，緊密連接蛋白被大量破壞?？瞻讓?duì)照組Occludin高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組低表達(dá)。見圖3。

氯吡格雷組空腸Occludin表達(dá)陰性率為90.0%，弱陽(yáng)性表達(dá)率為10.0%，陽(yáng)性表達(dá)率低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。氯吡格雷組回腸Occludin表達(dá)陰性率為100.0%，陽(yáng)性表達(dá)率為0.0%，陽(yáng)性表達(dá)率低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 4、5。

圖3 小鼠小腸黏膜組織學(xué)表現(xiàn) （Occludin抗體） （免疫組化）

表4 兩組空腸Occludin蛋白表達(dá)情況比較[n =10，例（%）]

表5 兩組回腸Occludin蛋白表達(dá)的比較 [n =10，例（%）]

3 討論

氯吡格雷在肝臟通過(guò)CYP2C19途徑代謝，其代謝產(chǎn)物與血小板P2Y12的二磷酸腺苷（ADP）受體結(jié)合，其抑制血小板聚集作用表現(xiàn)為抑制ADP介導(dǎo)的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的活化，對(duì)血小板ADP受體的作用是不可逆的。一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究顯示，口服氯吡格雷75 mg/d胃腸道出血風(fēng)險(xiǎn)1.9，4.2）與使用阿司匹林100 mg/d出血風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)[5]。盡管氯吡格雷可能不是胃十二指腸潰瘍的直接原因，但他們的抗血管生長(zhǎng)作用可能抑制了胃糜爛和其他藥物或者Hp感染所致的小潰瘍的愈合。在酸存在的情況下，這可能會(huì)導(dǎo)致一些較輕的沒(méi)有臨床癥狀的胃黏膜損害延遲愈合，甚至?xí)又爻蔀橛忻黠@臨床癥狀的潰瘍和出血[4]。有研究證實(shí)，氯吡格雷對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1具有直接損傷作用，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且呈現(xiàn)劑量依賴性；透射電鏡下顯示氯吡格雷作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生損傷性改變[6]。NSAIDs藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重性早已被人們意識(shí)到，但早期的研究主要集中在胃黏膜方面[7]。近期研究表明，雙氯芬酸等NSAIDs藥物的消化道不良反應(yīng)不僅出現(xiàn)在胃部，在小腸、結(jié)腸等部位也可見到嚴(yán)重的副作用。甚至有學(xué)者提出NSAIDs不良反應(yīng)主要在小腸而不是在胃及十二指腸。NSAIDs腸病根據(jù)癥狀有無(wú)亦分為兩類：無(wú)癥狀型NSAIDs腸病和有臨床表現(xiàn)的NSAIDs腸病兩類。無(wú)癥狀型NSAIDs腸病主要表現(xiàn)為黏膜通透性增加，黏膜炎癥等，一般不引起明顯的消化道癥狀。有臨床表現(xiàn)的NSAIDs腸病，則表現(xiàn)為蛋白丟失，出血和缺鐵性貧血，吸收障礙，小腸潰瘍，狹窄和穿孔等，都是嚴(yán)重的并發(fā)癥，其中小腸潰瘍的發(fā)生率相當(dāng)高。本研究發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠小腸黏膜層次結(jié)構(gòu)清楚，上皮結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，腺腔內(nèi)整潔；氯吡格雷組小鼠小腸腸管輕度粘連水腫，黏膜點(diǎn)狀糜爛及小潰瘍形成，小腸黏膜上皮脫落、壞死，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。提示氯吡格雷可以造成小鼠小腸黏膜損傷。

腸上皮的跨膜結(jié)合蛋白Occludin是構(gòu)成緊密連接（tight junction, TJ）的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，一旦發(fā)生變異、減少和缺失可引起腸上皮細(xì)胞間隙通透性增加[8]。腸黏膜屏障由腸黏膜上皮細(xì)胞及其間的連接復(fù)合體組成，其中最重要的是腸黏膜上皮細(xì)胞間的TJ[9]，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的TJ位于細(xì)胞側(cè)壁的頂部，分隔細(xì)胞頂面與基側(cè)面，防止上皮細(xì)胞間隙中的物質(zhì)溢出和大分子在細(xì)胞間隔中穿行，對(duì)腸道黏膜通透性起決定性作用。對(duì)屏障功能的維持和緊密連接的完整性具有重要作用[10]。有研究表明，缺乏Oecludin蛋白的成纖維細(xì)胞不能形成典型的TJ結(jié)構(gòu)[11]。對(duì)人、鼠、袋鼠、雞和狗的閉鎖蛋白cDNA進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，人、鼠、狗的閉鎖蛋白eDNA序列約90%同源，表明哺乳動(dòng)物的閉鎖蛋白在進(jìn)化上有一定的保守性。張爍等研究發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉可致大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞間TJ蛋白Oceludin表達(dá)下降，其mRNA水平也呈下凋趨勢(shì)，導(dǎo)致小腸黏膜TJ受損，促使小腸細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，誘發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，加重小腸黏膜損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠小腸黏膜層次結(jié)構(gòu)清楚，上皮結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，腺腔內(nèi)整潔；氯吡格雷組小鼠小腸腸管輕度粘連水腫，黏膜點(diǎn)狀糜爛及小潰瘍形成，小腸黏膜上皮脫落、壞死，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。提示氯吡格雷可以造成小鼠小腸黏膜損傷。本研究結(jié)果表明，Occludin蛋白主要表達(dá)于胞漿，氯吡格雷組Occludin蛋白較空白對(duì)照組減低，提示氯吡格雷可能降低小腸黏膜Occludin蛋白表達(dá)，致使黏膜屏障破壞，造成小鼠小腸黏膜損傷。但是氯吡格雷造成小腸黏膜損傷的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的臨床及基礎(chǔ)研究，為臨床安全用藥提供依據(jù)。