翟崇宇，陳俊強*，王 震，黎伯培，毛遠(yuǎn)天

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000）

胃癌（gastric carcinoma）是我國常見的惡性腫瘤，多發(fā)于年齡50歲以上的男性。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年新發(fā)胃癌病例大約在42.7萬，而每年死亡病例約30萬[1]，現(xiàn)已成為我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。胃癌早期無明顯癥狀，可存在輕微腹部不適，臨床誤診和漏診幾率大。而大多數(shù)胃癌在確診時已相對嚴(yán)重，導(dǎo)致無法單純使用手術(shù)進行治療。為此，如何尋找胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制，對于提高胃癌對化療藥物的敏感性以及臨床效果非常重要。既往研究顯示，環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程有直接的關(guān)系。其誘導(dǎo)生成的前列腺素E2（PGE2）可在一定程度上與相關(guān)受體進行結(jié)合，從而促進Bcl-1基因的表達(dá)，達(dá)到抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)的目的，減少胃癌細(xì)胞的凋亡[2]。近期有研究顯示，COX-2的選擇性抑制劑塞來昔布可有效地抑制胃癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)同時可以在憶當(dāng)年程度上抑制胃癌細(xì)胞的增殖和促進其凋亡[3]?；诖?，本次研究通過細(xì)胞流式技術(shù)觀察順鉑與5-氟尿嘧啶同塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用對胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡行為的影響，并探討其可能涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901材料于中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫采購。

1.2 儀器與材料

RPMI-1640培養(yǎng)液與標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibco，USA）；青霉素-鏈霉素混合液（碧云天公司，中國上海）；順鉑（齊魯制藥有限公司，中國）；5-氟尿嘧啶及塞來昔布（Aladdin，USA）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD，USA）；二甲基亞砜（DMSO）（Solarbio，USA）；PBS磷酸鹽緩沖液（干粉）（索萊寶科技有限公司，中國北京）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma，USA）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及吸管（Corning，USA）；電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠，中國）；流式細(xì)胞儀（BD，USA）。

1.3 方法

1.3.1 胃癌細(xì)胞SGC-7901的培養(yǎng)及藥物處理

（1）將冷凍儲存的胃癌細(xì)胞株SGC-7901，在1分鐘內(nèi)予以溶解，將胃癌細(xì)胞株SGC-7901溶解懸液置入培養(yǎng)基之中，并吹勻，以800 rpm進行離心處理，時間約為3分鐘。

（2）保留胃癌細(xì)胞株SGC-7901懸液沉淀，應(yīng)用培養(yǎng)基再次制備成為懸液，同時根據(jù)胃癌細(xì)胞的具體狀態(tài)，將5滴細(xì)胞懸液與4 ml培養(yǎng)基進行水平十字混合，保持37℃之中培養(yǎng)24小時。

（3）用1×PBS清洗細(xì)胞后更換培養(yǎng)基，混入約6 ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，一般每24～48 h更換一次。

（4）采用電子顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞株SGC-7901，如胃癌細(xì)胞占屏80%以上后，進行傳代。

（5）細(xì)胞懸液混合新培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)。

（6）觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，將其分為五個實驗組（參照組、順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組），同時建立6個藥物濃度梯度[4,5]對各組細(xì)胞分別進行的藥物作用處理。找到順鉑組、5-氟尿嘧啶組及塞來昔布組的半數(shù)抑制濃度分別為10.43±0.27 mg/L、156.56±2.07 mg/L、92.04±4.93 umol/L。

1.3.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同藥物治療模式下胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡情況

將各組經(jīng)半數(shù)抑制濃度作用24 h后的胃癌細(xì)胞株SGC-7901采用0.25%的胰酶進行消化，檢測中可在消化時混入2%牛血清白蛋白，避免消化過度而導(dǎo)致檢測結(jié)果存在偏差。在標(biāo)記前用1×緩沖液清洗胃癌細(xì)胞，去除細(xì)胞中的牛血清白蛋白，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

a.將貼于培養(yǎng)皿壁的胃癌細(xì)胞取下，于室溫條件下進行離心處理，轉(zhuǎn)速：2000 rpm時間：5～10分鐘；

b.再次用1×緩沖液清洗胃癌細(xì)胞，于室溫條件下進行離心處理，轉(zhuǎn)速：2000 rpm時間：5～10分鐘；

c.將300 μl1×緩沖液與細(xì)胞混合；

d.采用5 μlAnnexin V-FITC試劑與細(xì)胞懸液充分混合，室溫下靜置15～20分鐘（需予以避光處理）；

e.應(yīng)用200 μl1×緩沖液與細(xì)胞懸液充分混合；

f.將5 μlPI制劑與細(xì)胞懸液充分混合，予以檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料采用x2檢驗，采用例數(shù)（n）百分?jǐn)?shù)（%）表示，計量資料行t檢驗，以“±s”表示，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

參照組、順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡率分別為（7.10±0.30）%、（46.53±1.50）%、（39.17±1.10）%、（66.93±0.70）%、（62.13±1.60）%；與參照組相比，各組凋亡率明顯增加（P＜0.05），且順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增殖（P＜0.05）。（表1、圖1、圖2）

表1 各組細(xì)胞加入半數(shù)抑制濃度藥物后SGC7901細(xì)胞凋亡情況

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞株SCG-7901各實驗組經(jīng)藥物作用48小時后細(xì)胞凋亡率情況

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞株SCG-7901各實驗組經(jīng)藥物作用48小時后細(xì)胞凋亡率情況

3 討 論

順鉑和5-氟尿嘧啶藥品是臨床常用化療藥物，前者通過和腫瘤細(xì)胞中DNA結(jié)合，形成交叉鍵，進而對DNA復(fù)制行為起到了破壞作用。5-氟尿嘧啶藥物的胃癌細(xì)胞凋亡機制是通過藥物抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而使胃癌細(xì)胞DNA的合成行為受到抑制，促使胃癌細(xì)胞逐漸凋亡。但是，在臨床治療過程中，患者極易出現(xiàn)耐藥問題，致使胃癌患者化療效果難以保障，嚴(yán)重時甚至?xí)斐苫颊呋熓?，?yán)重威脅患者生命安全[6,7]。因此，應(yīng)進一步研究胃癌臨床化療藥物對胃癌細(xì)胞的凋亡行為，以便于保證患者化療效果。塞來昔布藥物作為一種非特異性環(huán)氧化酶抑制劑，具有抗炎、解熱或鎮(zhèn)痛等臨床作用，也成為胃癌患者臨床治療的藥劑。

近年來，研究非特異性環(huán)氧化酶抑制劑在胃癌臨床治療中的研究成果較少，尤其是與化療藥物相互聯(lián)合應(yīng)用方面。Tendo M、Yashiro M等人[8]采用胃癌腹膜轉(zhuǎn)移裸鼠模型化療藥物與非特異性環(huán)氧化酶抑制劑作用的影響，其結(jié)果顯示經(jīng)口予非特異性環(huán)氧化酶抑制劑JTE-522與S-1聯(lián)合應(yīng)用于胃癌腹膜轉(zhuǎn)移治療效果較好，說明非特異性環(huán)氧化酶抑制劑與S-1聯(lián)合應(yīng)用模式具有臨床治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的價值。Chen M、Yu L等人[9]研究結(jié)果表明，非特異性環(huán)氧化酶抑制劑能夠避免胃癌患者順鉑發(fā)生耐藥反應(yīng)，但是在裸鼠移植瘤模型研究結(jié)果中顯示，塞來昔布和順鉑聯(lián)合模式的胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡效果并未予以凸顯。鑒于此，究竟化療藥與COX-2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用能否提高胃癌的化療效果目前仍存在爭議。塞來昔布作為非特異性環(huán)氧化酶抑制劑的代表性藥物，其抗胃癌效果較為明顯。本研究結(jié)果顯示，與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組治療效果較好，藥物在聯(lián)合作用后能夠促進胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡行為，抑制細(xì)胞增殖，增強藥物敏感性。

綜上所述，順鉑、5-氟尿嘧啶聯(lián)合塞來昔布用藥相較于單一用藥可以進一步促進胃癌細(xì)胞凋亡，但是否與P53、蛋白激酶A、AKT、Fas、Bcl-2/Bax、Bak、caspase-9等蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)及相關(guān)通路有關(guān)需進一步研究。