楊 偉,陳如炎,徐 響,趙 通,李 根,郝一博,王文娟,焦夢婷,張 浩,李 波,*

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京 100093)

魚膠原蛋白肽(CP)分子量小,具有較高的營養(yǎng)價值和生物活性,能夠100%被人體吸收利用,常用于功能性食品、飲料和化妝品中[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中的主要活性成分,具有優(yōu)良的抗菌性和抗氧化活性,被廣泛用作功能食品添加劑,作為藥品或保健品應(yīng)用于減肥、慢性疾病和亞健康人群中[2-6]。多酚能夠與蛋白質(zhì)和多肽通過非共價鍵(氫鍵、疏水作用和范德華力等)結(jié)合,在一定條件下聚集形成可逆的亞微米復(fù)合物[7-8]。這類亞微米復(fù)合物一般濁度較大,常被認(rèn)為是影響葡萄酒、啤酒、黃酒等酒類產(chǎn)品以及茶飲料和果蔬汁飲料感官品質(zhì)的主要原因[9-12]。

許多因素能夠干擾蛋白質(zhì)-多酚亞微米復(fù)合物的形成[13]。研究表明,果膠、黃原膠和阿拉伯膠等陰離子多糖能夠影響蛋白質(zhì)和多酚的聚集,其主要機制是在溶液中形成以蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物為核,多糖為殼的“蛋白質(zhì)-多酚-多糖三者復(fù)合物”,通過增加復(fù)合物的水溶性而抑制蛋白質(zhì)-多酚聚集體的形成[14-15]。最新研究表明,除了陰離子多糖外,一些分子量較小的食品功能性因子,如CP,也能夠抑制蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成[16]。Yang等[16]采用三種自組裝順序,研究了CP對乳鐵蛋白(LF)和EGCG所形成濁度的抑制作用,研究發(fā)現(xiàn),CP能夠與吸附在LF表面的EGCG發(fā)生競爭,通過形成粒徑較小的LF-EGCG-CP三元復(fù)合物而使溶液濁度降低,但LF結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著變化。α-乳白蛋白(α-La)是一類重要的乳蛋白,作為壁材,能夠包埋、運載、傳遞EGCG[17]。但在一定條件下,α-La能夠與EGCG形成混濁沉淀,進(jìn)而限制了α-La-EGCG復(fù)合物在澄清溶液中的應(yīng)用。熱處理是許多食品加工中重要的步驟,CP對蛋白質(zhì)與多酚聚集行為的影響可能受環(huán)境因素,尤其熱加工處理的影響。

本文通過測定α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物的濁度、粒徑、電位、熒光光譜和圓二色譜,在室溫(25 ℃)條件下研究CP對α-La與EGCG聚集行為的影響,并在70 ℃條件下對所形成的三元復(fù)合物體系進(jìn)行熱處理,研究α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物聚集體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性,為解決α-La-EGCG復(fù)合物在澄清溶液中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚膠原蛋白肽(CP) 純度≥99%,來源于羅非魚魚皮,平均分子量2000 Da,北京盛美諾生物技術(shù)有限公司;α-乳白蛋白(α-La) 純度≥95%,美國Agropur公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) 純度≥98%,美國Sigma公司;其它所用化學(xué)藥品 均為分析純。

2100N型濁度計 美國HACH公司;Zetasizer Nano-ZS型激光粒度儀 英國Malvern公司;Cary-Eclipse型熒光分光光度計 美國安捷倫公司;Pistar π-180型圓二色譜 英國應(yīng)用光物理公司。

1.2 實驗方法

1.2.1α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物的制備 在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)中,分別配制0.6 mmol/Lα-La和5.0 mmol/L的EGCG母液。按三種不同的添加順序制備α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物，室溫為25 ℃。

處理組1:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入1.0 mL濃度分別為15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,繼續(xù)混合1 min后靜置2 h。制備的三元復(fù)合物記為SATx-1(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-1和SAT70 ℃-1分別表示采用第一種添加順序制備的室溫自組裝三元復(fù)合物和70 ℃條件下熱處理三元復(fù)合物。

處理組2:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL濃度分別為15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,繼續(xù)混合1 min后靜置2 h。制備的三元復(fù)合物記為SATx-2(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-2和SAT70 ℃-2分別表示采用第二種添加順序制備的室溫自組裝三元復(fù)合物和70 ℃條件下熱處理三元復(fù)合物。

處理組3:取1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液和1.0 mL濃度分別為15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液繼續(xù)混合1 min后靜置2 h。制備的三元復(fù)合物記為SATx-3(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-3和SAT70 ℃-3分別表示采用第三種添加順序制備的室溫自組裝三元復(fù)合物和70 ℃條件下熱處理三元復(fù)合物。

空白對照組:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,利用渦旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均勻,靜置2 h后加入1.0 mL緩沖溶液,繼續(xù)混合1 min后靜置2 h。

α-Lax(x=25和70 ℃)分別表示在室溫條件和70 ℃加熱條件下的α-La溶液。

1.2.2 濁度測定 采用2100 N濁度儀測定樣品的濁度。測定溫度為25 ℃。濁度儀采用90°散射光原理,在恒定入射光條件下,散射光強度與溶液的渾濁度成正比。

1.2.3 粒徑和zeta電位(ζ-電位)測定 采用Zetasizer Nano-ZS激光粒度儀室溫分析三元復(fù)合物的粒徑大小和ζ-電位,同時用多分散系數(shù)(Polydispersity Index,PdI)表示粒徑分布。

1.2.4 熒光光譜測定 采用Cary-Eclipse熒光分光光度計進(jìn)行熒光光譜掃描,其中激發(fā)波長為292 nm,激發(fā)縫寬和發(fā)射縫寬均為10 nm,記錄熒光強度的變化。

1.2.5 圓二色譜測定 采用Pistar π-180型圓二色譜儀測定三元復(fù)合物中α-La的二級結(jié)構(gòu)。取0.4 mLα-La濃度為0.02 mg/mL的樣品于樣品池中,樣品池的光徑為0.1 cm,掃描波長范圍為190～260 nm,溫度為25 ℃,掃描速度為100 nm/min,累計次數(shù)3次,記錄CD圖譜。同樣實驗條件下測定檸檬酸鹽緩沖溶液的圓二色譜為空白。根據(jù)DICHROWEB的方法計算二級結(jié)構(gòu)的百分含量[18-20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實驗至少重復(fù)兩次,每個樣品至少檢測三組數(shù)據(jù),結(jié)果用平均值M±標(biāo)準(zhǔn)差SD來表示。運用SPSS 18.0軟件,采用Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,顯著水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 CP濃度對三元復(fù)合物濁度的影響

在10 mmol/L pH3.0檸檬酸鹽緩沖液中,當(dāng)EGCG濃度為1.25 mmol/L 時,α-La-EGCG復(fù)合物的濁度為(604±30) NTU。經(jīng)70 ℃熱處理后,α-La-EGCG復(fù)合物的濁度為(1900±50)NTU,較之25 ℃條件下增加3.15倍左右,這可能與α-La-EGCG復(fù)合物的熱聚集有關(guān)。

如圖1a所示,采用三種添加順序制備的α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物,它們濁度隨CP濃度的增加表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律,即先增大后減小。當(dāng)CP濃度為15～30 mg/mL時,SAT25 ℃-1濁度略有增加,而SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3濁度增加明顯;當(dāng)CP濃度為60和75 mg/mL時,SAT25 ℃-1的濁度分別減小了46.5%和76.8%,SAT25 ℃-2的濁度分別減小了32.1%和56.5%,SAT25 ℃-3的濁度分別減小了42.1%和70.7%。換句話說,利用三種添加順序制備的α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物中,當(dāng)CP濃度較低時,CP能夠促進(jìn)不溶性沉淀的形成,而當(dāng)CP濃度較高時,CP能夠較好的抑制α-La與EGCG不溶性沉淀的形成,使溶液濁度降低,且處理組1最有效。低濃度的CP會增加溶液中不溶性聚集物的形成可能是由于CP能夠吸附在LF-EGCG復(fù)合物表面,從而使復(fù)合物的粒徑增加,但由于含量較少,不足以溶解復(fù)合物,因此,溶液濁度增加。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn),添加CP并沒有使LF和EGCG形成的不溶性聚集物濁度增加,這可能是本文所用的原料和溶液環(huán)境與其不同有關(guān)。處理組1、處理組2和處理組3制備的溶液濁度隨CP的添加所表現(xiàn)出的不同增強或降低濁度的能力,說明溶液的濁度與α-La、EGCG和CP的添加順序有直接關(guān)系。

圖1 CP濃度對SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)濁度的影響Fig.1 Influence of CP concentration on the turbidity of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

SAT70 ℃濁度表現(xiàn)出與SAT25 ℃不同的變化規(guī)律:在CP濃度為15 mg/mL時,SAT70 ℃濁度較之SAT25 ℃高;在CP濃度為22.5 mg/mL時,SAT70 ℃濁度與SAT25 ℃差異不明顯;在CP濃度較高(≥30 mg/mL)時,SAT70 ℃濁度較之SAT25 ℃低;同時,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3具有相同的變化規(guī)律,均隨CP濃度的增加而減小,且三種處理組所得溶液濁度差異性不明顯(圖1b)。這可能是因為:通過三種添加順序制備的SAT25 ℃因熱的作用(70 ℃,20 min)重新組裝,進(jìn)而形成結(jié)構(gòu)相同且均一的α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物。

總之,較高CP濃度條件下,三種處理組制備的SAT25 ℃溶液濁度較小,溶液中α-La-EGCG復(fù)合物形成的濁度受到了抑制;處理組1最有效,其次是處理組3和處理組2。熱處理能夠增加α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物的溶解性。

2.2 CP濃度對三元復(fù)合物粒徑的影響

圖2為CP濃度對α-La-EGCG復(fù)合物的粒徑和粒徑分布的影響。從圖2可以看出,隨著CP濃度的增加,SAT25 ℃和SAT70 ℃平均粒徑變化規(guī)律與濁度基本一致。

圖2 CP濃度對SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)粒徑和PDI的影響Fig.2 Influence of CP concentration on the particle size and PDI of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

對于SAT25 ℃,當(dāng)CP濃度較低(≤ 45 mg/mL)時,由于CP主要吸附在α-La-EGCG復(fù)合物表面,CP的濃度不足以抑制聚集物的形成,因此α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物粒徑變大,且PDI較大;當(dāng)CP濃度為75 mg/mL時,SAT25 ℃的粒徑變小(SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3分別為(543±78),(506±12)和(954±90) nm,且PDI較小(SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3的PDI由0.419分別降至0.017、0.12和0.035),表明溶液中的α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物分布變得均一。

對于SAT70 ℃,SAT70 ℃的粒徑隨CP濃度的增加而減小。但與SAT25 ℃相比,SAT70 ℃的粒徑較大,推測可能與α-La、α-La-EGCG復(fù)合物或α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物的熱聚集有關(guān)。同時,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3的PDI由0.996分別降至0.233、0.182和0.126,表明熱處理使溶液中三元復(fù)合物的分布變得均勻。

2.3 CP濃度對三元復(fù)合物ζ-電位的影響

ζ-電位是衡量水溶液中復(fù)合物穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。圖3為SAT25 ℃和SAT70 ℃隨CP濃度的增加ζ-電位的變化情況,從中可得,隨著CP濃度的增加,三元復(fù)合物溶液的ζ-電位減小,當(dāng)CP濃度大于45 mg/mL時,三元復(fù)合物溶液的ζ-電位接近于0。這與Yang等[16]的相關(guān)研究結(jié)果不同,這主要與CP所帶電荷不同有關(guān)。應(yīng)當(dāng)指出的是,盡管溶液的ζ-電位隨著CP濃度的增加而減小,但溶液的濁度減小,穩(wěn)定性增強,這可能與CP抑制蛋白質(zhì)-多酚聚集體形成的機理有關(guān)。Yang等[16]認(rèn)為,CP能夠抑制LF-EGCG聚集體的形成,主要是因為CP能夠通過競爭作用和空間位阻干擾LF與EGCG的結(jié)合[16]。因此推測,高濃度CP條件下,SAT25 ℃和SAT70 ℃濁度較低但穩(wěn)定性較高的主要原因可能與CP的競爭作用,尤其是空間位阻作用有關(guān)。

圖3 CP濃度對SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)ζ-電位的影響Fig.3 Influence of CP concentration on the ζ-potential of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

2.4 CP濃度對三元復(fù)合物熒光強度的影響

α-La分子含有4個色氨酸殘基[21]。如果基團(tuán)在天然蛋白質(zhì)的內(nèi)部,色氨酸峰值可能發(fā)生藍(lán)移;如果蛋白分子舒展,色氨酸峰值可能發(fā)生紅移[22]。通過監(jiān)測色氨酸發(fā)射峰的變化,可以獲取相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)變化和熒光團(tuán)周圍微環(huán)境的變化。

圖4a～圖4c為SAT25 ℃隨著CP濃度的增加熒光光譜變化。隨著CP濃度的增加,SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3均發(fā)生明顯的熒光淬滅,熒光強度由100%分別降至22.5%、24.6%和23.2%;同時,CP使三元復(fù)合物的發(fā)射峰發(fā)生紅移,分別由361 nm移至376、373和374 nm。這說明α-La與CP之間存在較強的結(jié)合能力,CP的加入顯著改變了α-La的結(jié)構(gòu),α-La分子中色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了顯著變化。因此推測,對于SAT25 ℃,CP與α-La-EGCG之間的相互作用導(dǎo)致α-La結(jié)構(gòu)更加伸展,α-La分子中色氨酸的親水性增強。

圖4 CP濃度對SAT25 ℃和SAT70 ℃的熒光強度(a～f)和熒光強度變化率(g)的影響Fig.4 Influence of CP concentration on the fluorescence intensity (a～f) and fluorescence intensity change rate(g)of SAT25 ℃ and SAT70 ℃

圖4d～f為SAT70 ℃隨著CP濃度增加的熒光光譜變化。α-La-EGCG復(fù)合物在70 ℃熱處理較之25 ℃條件下,熒光強度增強,且發(fā)生了顯著的藍(lán)移,這與熱處理使α-La分子熱變性,結(jié)構(gòu)更加伸展、疏水性增強有關(guān)。隨著CP濃度的增加,SAT70 ℃的熒光光譜變化規(guī)律與SAT25 ℃相似,即熒光強度明顯降低,發(fā)射峰紅移(圖4g)。值的注意的是,SAT70 ℃的熒光淬滅程度較之SAT25 ℃明顯。例如,當(dāng)CP濃度為75 mg/mL時,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3熒光強度較α-La-EGCG復(fù)合物的熒光強度分別降低12.3%、13.4%和12.0%,而SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3熒光強度較α-La-EGCG復(fù)合物的熒光強度分別降低22.5%、24.6%和23.2%,說明CP在SAT70 ℃中較之在SAT25 ℃中更加接近α-La。因此推測,對于SAT70 ℃,雖然熱處理使α-La-EGCG復(fù)合物疏水性增強,但當(dāng)加入CP后,CP與α-La-EGCG之間的相互作用同樣導(dǎo)致α-La結(jié)構(gòu)更加伸展,α-La分子中色氨酸的親水性進(jìn)一步增強。

2.5 CP濃度對三元復(fù)合物中α-La二級結(jié)構(gòu)的影響

為獲取更多CP引起α-La二級結(jié)構(gòu)變化的信息,采用遠(yuǎn)紫外圓二色譜對復(fù)合物進(jìn)行分析。如圖5a所示,在190～260 nm波長范圍內(nèi),α-La-EGCG復(fù)合物的圓二色譜在208～210 nm處具有較寬的峰,在218～220 nm處具有肩峰。采用DICHROWEB測定α-La二級結(jié)構(gòu)的含量。α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲通過CDSSTR進(jìn)行測定,結(jié)果如圖5b所示。

圖5 α-La-EGCG二元復(fù)合物和α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物(EGCG含量為1.25 mmol/L)遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖(a)和二級結(jié)構(gòu)含量(b)Fig.5 Far-UV circular dichroism spectra of α-La-EGCG binary complex and α-La-EGCG-CP ternary complex (EGCG content 1.25 mmol/L)(a) and secondary structure content(b)

在α-La-EGCG復(fù)合物(EGCG含量為1.25 mmol/L)中,α-La含有29%α-螺旋、20%β-折疊、22%β-轉(zhuǎn)角和30%無規(guī)則卷曲。而在SAT25 ℃中,α-La含有較多的α-螺旋(42%),β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲均減小,這可能與CP與α-La的結(jié)合有關(guān)。CP的添加引起了α-La二級結(jié)構(gòu)的改變。該結(jié)果與熒光光譜結(jié)果一致。

SAT70 ℃中α-La的結(jié)構(gòu)與SAT25 ℃中的大致相同,僅β-折疊和β-轉(zhuǎn)角減小1%,而無規(guī)卷曲含量增加2%。由此推之,熱處理對α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物中α-La的結(jié)構(gòu)略有影響。

CP對α-La-EGCG聚集物可能的抑制機制是:當(dāng)CP濃度較低時,不足以抑制α-La-EGCG聚集體的形成,而主要吸附在α-La-EGCG聚集物表面,因此復(fù)合物粒徑較大,PDI較大;當(dāng)CP濃度較高時,CP能夠通過競爭作用或空間位阻破壞EGCG對α-La的橋聯(lián)作用,從而形成粒徑和粒徑分布較小的三元復(fù)合物。熱處理能夠使復(fù)合物(α-La-EGCG復(fù)合物和/或α-La-EGCG-CP復(fù)合物)中的α-La變性聚集,進(jìn)而使復(fù)合物的粒徑增大。

3 結(jié)論

當(dāng)CP濃度較低時,主要通過吸附機制形成粒徑較大的不溶性α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物,而當(dāng)CP濃度較高時,主要通過競爭機制或空間位阻效應(yīng),形成粒徑較小的α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物。CP對復(fù)合物粒徑和濁度的影響取決于α-La、EGCG和CP的添加順序。熱處理能夠進(jìn)一步減小α-La-EGCG-CP三元復(fù)合物的濁度。總之,CP干擾α-La與EGCG聚集的能力及所形成三元復(fù)合物的熱穩(wěn)定性,能夠為α-La-EGCG復(fù)合物在澄清溶液中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。