張雪春，劉 江，吳 鑫，沈文杰，李 軍，師紅玲，王振興1,*

(1.西南林業(yè)大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學輕工與食品工程學院，云南 昆明 650224；3.江西師范大學功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌 330022)

【研究意義】蛇莓(Duchesneaindica(Andr.)Focke in Engler)為薔薇科蛇莓屬植物，別名蛇泡草、龍吐珠、三爪風等，為民間常用草藥，廣泛分布于中國東部、中部、南部和西南部，傳統(tǒng)醫(yī)學認為其具有清熱解毒、消腫散瘀，收斂止血、涼血等功效[1]。蛇莓中含有酚酸類、三萜類、黃酮類、鞣花酸類、甾醇類等化學成分，藥理學實驗發(fā)現(xiàn)蛇莓具有抗腫瘤、抗氧化、抗白血病、抗誘變、抑制中樞神經(jīng)、抗菌、調節(jié)機體免疫功能等功效[2-3]。研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥、阿爾茲海默綜合癥可能和體內(nèi)自由基氧化反應均有一定相關性[4-5]，目前治療2型糖尿病的有效方法是通過抑制體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性來降低餐后或者空腹血糖，控制或治療阿爾茲海默綜合癥的有效方法是抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性。因此研究蛇莓的抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶能力和抑制乙酰膽堿酯酶能力，可為防衰老、糖尿病防治和抗老年癡呆方面的研究提供一定參考，對提高蛇莓的利用價值也有重要意義。【前人研究進展】目前對蛇莓的抗氧化活性、降血糖和防治老年癡呆方面的研究較少，如王予祺[6]發(fā)現(xiàn)蛇莓的酚性提取物清除DPPH自由基的IC50值為76.76 μg/mL，能保護小鼠肝臟、腦和惡性腫瘤引起的氧化損傷；趙萍[7]從蛇莓提取液中分離得到13個組分，對DPPH自由基和絡氨酸酶的抑制率均可達90 %以上。茍體忠等[8]發(fā)現(xiàn)蛇莓的乙醇提取物具有清除DPPH自由基的能力，其IC50值為18.2 μg/mL；劉素君等[9]發(fā)現(xiàn)蛇莓的提取物具抑制志賀桿菌、金黃色葡萄球菌的作用，并具有較好的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力?！颈狙芯壳腥朦c】蛇莓中的酚類成分可能是其主要活性成分[10]，因此，文章以蛇莓多酚為研究對象，研究其最佳提取條件、通過體外試驗評價其抗氧化活性、降血糖和防治老年癡呆能力?！緮M解決的關鍵問題】探討不同微波條件對蛇莓總酚得率的影響，考察其DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、鐵還原能力，評價其抑制α-葡萄糖苷酶能力和乙酰膽堿酯酶能力，從而為蛇莓的深入研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蛇莓：采自云南省宣威市海岱鎮(zhèn)沙烏村，取其全草經(jīng)曬干后備用；釀酒酵母a-葡萄糖苷酶、電鰻乙酰膽堿酯酶(AChE)、4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)、阿卡波糖(Acarbose)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB)、碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)、加蘭他敏(Galanthamine，GLTM)，購于Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2’-聯(lián)氮,-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、抗壞血酸(Vc)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、槲皮素(Quercetin，Qc)，以及沒食子酸、Folin-Ciocalteus試劑等均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

BT244S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、P70D20P-TD(W0)型微波爐(廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司)、DGH-9140A數(shù)顯電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、RE-52系列旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、SYNERGY H1多功能酶標儀(美國BIOTEK公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 微波輔助提取蛇莓多酚 蛇莓全草經(jīng)粉碎后過40目篩，取1.0 g蛇莓粉，加入一定體積的甲醇溶液，攪拌均勻，以保鮮膜覆蓋，置于微波爐中微波輔助提取一定時間，提取后進行抽濾，取濾渣以相同條件再次提取1次，合并前后2次濾液，在50 ℃下真空旋干，即得到蛇莓多酚(DI)。

1.3.2 單因素試驗設計 分別固定其它因素，依次考察甲醇濃度(50 %、60 %、70 %、80 %、90 %)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30，W/V)、微波時間(30、60、90、120、150 s)、微波功率(119、280、462、595、700 W)對總酚得率的影響。

1.3.3 條件優(yōu)化 在單因素試驗的基礎上，以料液比、微波時間、微波功率、甲醇濃度為自變量，以總酚得率為響應值，利用Box-Behnken原理，設計4因素3水平中心組合試驗，用Design-Expert8.05b軟件進行響應面優(yōu)化分析，確定最佳提取條件，因素水平編碼表見表1。

1.3.4 總酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法[11]測定總酚含量，用酶標儀在765 nm處測定，以不同濃度的沒食子酸為標準物繪制標準曲線，以沒食子酸當量(g GAE/mL)表示蛇莓提取物中總酚含量，按下式計算樣品中總酚得率。

(1)

式中：V為提取液體積(mL)；C為提取液中多酚濃度 (g GAE/mL)；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質量(g)。

1.3.5 蛇莓提取物清除DPPH自由基能力的測定 參考王白娟[12]的方法，采用酶標儀在517 nm處測定，以Vc、BHT和槲皮素(Qc)為陽性對照。

1.3.6 蛇莓提取物清除ABTS+自由基能力的測定 參照Xie[11]的方法，采用酶標儀在734 nm處測定，以Vc、BHT和槲皮素為陽性對照。

1.3.7 蛇莓提取物鐵還原能力的測定 參考馬承慧[13]的方法，采用酶標儀在593 nm處測定，以FeSO4為標準物繪制標準曲線，樣品的鐵還原能力(FRAP)用FeSO4當量表示(μg FeSO4/g)，同時以Vc、BHT和槲皮素為陽性對照。

1.3.8 蛇莓提取物抑制α-葡萄糖苷酶能力的測定 參考Liao[14]的方法并加以改進，取50 μl稀釋到合適濃度的樣品溶液加入96孔黑色熒光酶標板中，加入50 μl 4-MUG溶液(84 μM，用50 mM pH 6.8磷酸鉀緩沖液配置)，再加入20 μl α-葡萄糖苷酶溶液(0.1 U/mL，用50 mM pH 6.8磷酸鉀緩沖液配置)，充分混勻后在37 ℃避光溫育20 min，再加入100 μl甘氨酸-NaOH溶液(100 mM，pH 10.6)終止反應，振蕩30 s，最后在激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm下測定熒光強度(As)，以樣品溶劑代替樣品的反應為空白(Ac)，用磷酸鉀緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液的反應為樣品空白(Ab)，抑制率計算按下式(2)，同時以阿卡波糖為陽性對照。

(2)

1.3.9 蛇莓提取物抑制乙酰膽堿酯酶能力的測定 參考Sheeja[15]的方法，采用酶標儀在405 nm處測定，以加蘭他敏為陽性對照。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 所有試驗均測定3次，以平均值±標準偏差來表示試驗結果。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Design Expert 8.05b軟件進行響應面試驗設計和數(shù)據(jù)分析，采用Origin 2017軟件進行曲線擬合來計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果如圖1中a、b、c、d所示。由圖1a可知，蛇莓總酚得率隨甲醇濃度的增大而呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當甲醇濃度為70 %時總酚得率達到最高值5.2 %±0.29 %，此時繼續(xù)增大甲醇濃度，得率反而下降。由圖1b可知，蛇莓總酚得率隨料液比的增大而呈現(xiàn)先上升后緩慢下降趨勢，當料液比為1∶20時，總酚得率最高，達5.14 %±0.2 %。圖1a和圖1b的結果和郭婕[16]等人的報道是一致的，主要是因為植物中的不溶性酚類在細胞壁上與蛋白質、多糖以氫鍵和疏水鍵結合，甲醇-水溶液可以破壞氫鍵，使得酚類物質溶出。提取溶劑中水的比例過高，多糖等成分溶出較多。提取溶劑中甲醇過高，可引起細胞中蛋白質變性，影響酚類物質溶出。增大溶劑用量，有利于多酚由原料向溶劑擴散，增加其提取率，但溶劑用量過大，需要濃縮蒸發(fā)等處理的時間更長，酚類物質更容易降解，導致得率下降，且造成溶劑浪費。

由圖1c可知，蛇莓總酚得率隨微波時間的延長而呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當微波時間為120 s時達到最高的5.09 %±0.16 %。由圖1可知，當微波功率為280 W時，總酚得率達到最高的5.06 %±0.19 %，之后隨著微波功率的增大，總酚得率呈下降的趨勢。原因是延長微波時間或者增大微波功率，提取液的溫度不斷上升，使酚類物質的溶出量增大；但當微波時間過長或者功率過大，使得提取液的溫度過高，導致部分酚類物質被氧化或分解，從而使得率下降。

圖1 提取條件對總酚得率的影響Fig.1 Effect of each condition on the content of total phenols

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據(jù)單因素試驗結果，依次選擇甲醇濃度、料液比、微波功率、微波時間為響應面因素，以蛇莓總酚得率為響應值，通過Design Expert 8.05b軟件，設計4因素3水平響應面試驗進行提取優(yōu)化，因素水平表和試驗結果見表1～2。

表1 響應面因素及水平表

表2 Box-Behnken試驗設計和總酚得率結果

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗

對表2中試驗結果進行回歸分析，得到回歸模型方程Y=5.09-0.15A-0.070B-0.16C-0.098D-0.050AB-0.16AC-0.050AD-0.028BC-0.57BD-0.21CD-0.14A2-0.34B2-0.55C2-0.48D2。模型系數(shù)顯著性結果和方差分析結果見表3。

對方程進行優(yōu)化，剔除不顯著項AB、AD、BC，得到優(yōu)化后的方程Y=5.09-0.15A-0.070B-0.16C-0.098D-0.16AC-0.57BD-0.21CD-0.14A2-0.34B2-0.55C2-0.48D2。由表3可知，此模型的P值極顯著(P<0.0001)，R2=0.9792，表示方程能較好地反映各因子與響應值的關系并預測最佳合成條件，失擬項P值為不顯著，表明模型擬合程度較好，可用此模型對微波提取蛇莓總酚進行分析和預測。

2.2.2 各因素相互作用分析 根據(jù)優(yōu)化后的回歸方程，分別作各因素之間的響應面分析圖，各因素交互作用對蛇莓總酚得率的影響結果見圖2，各因素相應曲線的陡峭程度反映了該因素對蛇莓多酚得率的影響程度，各因素交互作用的等高線呈橢圓形，則說明兩者交互作用極為顯著。由圖2結合表2方差分析可知，各因素對蛇莓總酚得率的影響次序：微波功率>料液比>甲醇濃度>微波時間。

2.2.3 最優(yōu)條件的驗證 對方程求導可知，當料液比為1∶18.35、微波時間為109.33 s、微波功率為264.66 W、甲醇濃度為66.66 %時，總酚得率最高，其理論值為5.15 %。在該條件進行驗證實驗。為方便操作，選取料液比為1∶18、微波時間為110 s、微波功率為280 W、甲醇濃度為67 %，試驗平行3次，測定總酚得率為5.21 %±0.16 %，接近理論值，證明該模型可行。

2.3 蛇莓多酚體外抗氧化能力試驗結果

2.3.1 清除DPPH自由基能力 DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，樣品對DPPH自由基清除能力代表樣品具有清除羥自由基、烷自由基、過氧自由基、阻止脂質過氧化反應的作用，常用于反映樣品抗氧化能力強弱[6]。由圖3可知，蛇莓多酚具有較強的清除DPPH自由基能力，且清除能力隨著樣品濃度的增大而增強。蛇莓多酚清除DPPH自由基的IC50值為(8.63±0.4)μg/mL，接近于Vc(8.13±0.52)μg/mL，顯著低于BHT(17.7±0.52)μg/mL和槲皮素(81.1±6.04)μg/mL。

圖2 各因素和總酚得率的交互作用Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the total phenol yield

圖3 蛇莓多酚與對照清除DPPH自由基的能力Fig.3 The DPPH scavenging ability of sample and control

圖4 蛇莓多酚與對照清除ABTS+自由基的能力Fig.4 The ABTS+ scavenging ability of sample and control

2.3.2 清除ATBS+自由基能力 ABTS法是使用最廣泛的抗氧化能力間接檢測方法，可用于親水性和親脂性物質抗氧化能力測定。ABTS+溶液可釋放穩(wěn)定的有機自由基，樣品中的還原性物質可提供電子，與該有機自由基反應，因此可通過測定反應體系吸光度的變化，來反映樣品抗氧化能力的大小。由圖4可知，隨著蛇莓多酚濃度的增大，其對ABTS+自由基的清除能力不斷增強，在濃度為75.68 μg/mL時清除率達到98.46 %±0.4 %。蛇莓多酚清除ABTS+自由基的IC50值為(32.11±1.48)μg/mL，雖然高于Vc(19.15±0.56)μg/mL和BHT(20.81±0.82)μg/mL，但顯著低于槲皮素(66.47±2.03)μg/mL。

圖5 蛇莓多酚與對照的FRAP能力Fig.5 The FRAP ability of sample and control

2.3.3 鐵還原能力 在酸性條件下，F(xiàn)e3+與TPTZ生成復合物，樣品中的還原性物質可將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+在593 nm處有最大吸收，因此可通過測定反應體系在593 nm處的吸光度值，以FeSO4為標準物質來反映樣品鐵還原能力，結果記為FRAP值，F(xiàn)RAP值越大，表明該樣品的總抗氧化能力越強[17]。由圖5可知，蛇莓多酚的FRAP值為(2 190.32±6.46)μg FeSO4/mL，低于Vc(5 368.06±237.77)μg FeSO4/mL和BHT(3 002.22±102.88)μg FeSO4/mL，接近槲皮素(2 386.96±168.68)μg FeSO4/mL。可能是因為樣品中的其他各種成分如膠體、淀粉、蛋白等物質干擾了反應體系中Fe3+與TPTZ生成復合物，導致反應體系中產(chǎn)生的Fe2+濃度低于對照的Vc和BHT。

2.4 抑制α-葡萄糖苷酶能力試驗結果

糖尿病是一種全球性的慢性疾病，它可引起患者代謝異常，不僅導致高血糖癥，而且引起許多并發(fā)癥，嚴重危害人類健康，控制并降低患者的血糖含量(特別是餐后血糖含量)是糖尿病防治的關鍵措施。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前已經(jīng)確定的對Ⅱ型糖尿病有著確切療效的降糖類藥物，其通過可逆性競爭抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而延緩小腸對葡萄糖的吸收利用，達到降低餐后血糖水平的目的[18]。如圖6所示，蛇莓多酚抑制α-葡萄糖苷酶的能力隨濃度增大顯著增大，其IC50值為(223.89±51.07 )μg/mL，低于對照物阿卡波糖(310.81±56.73)μg/mL，表明蛇莓可以作為一種高效的天然降血糖資源。

2.5 抑制乙酰膽堿酯酶能力試驗結果

阿爾茨海默病，即老年性癡呆癥，是最常見的老年化神經(jīng)衰退癥?；颊叽竽X內(nèi)神經(jīng)遞質乙酰膽堿的缺失是導致疾病的關鍵原因，乙酰膽堿酯酶(AChE)可催化乙酰膽堿的裂解，導致乙酰膽堿缺失，因此抑制AChE的活性是臨床上治療阿爾茲海默綜合癥的重要手段[19]。由圖7可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，蛇莓多酚抑制AChE的能力隨濃度增大而增大，其IC50值為(202.95±22.68)μg/mL，與Khuda[20]的結果(226±0.26)μg/mL基本一致，雖然低于對照物加蘭他敏的(1.06±0.13)μg/mL，但顯著高于一些常見藥材的3～15 mg/mL[21]。

3 討 論

文章采用微波輔助提取蛇莓多酚，微波輔助提取是微波和傳統(tǒng)的溶劑提取法相結合的一種提取方法，在萃取過程中，微波能量使得物料細胞內(nèi)部破裂，其有效成分自由流出，在較低溫度下溶解于萃取介質中，具有高效、低溫、可選擇性萃取等優(yōu)點[22]。以總酚得率為考察指標，相比傳統(tǒng)浸泡提取方法[23]，文章的提取時間由3～7 d縮短至112 s，多酚得率由2.14 %提高至5.21 %，提取物的抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶能力都有顯著的提高。因此，微波輔助提取適用于蛇莓中活性成分的高效提取。

體外抗氧化試驗表明，蛇莓多酚對DPPH自由基、ATBS+自由基有較強的清除能力，接近或者超過常用的商業(yè)化抗氧化劑Vc和BHT，顯著高于槲皮素。其鐵還原能力雖然低于Vc和BHT，但接近槲皮素。蛇莓中的多酚類化合物可能是其主要活性物質，可經(jīng)進一步分離純化后，開發(fā)為天然抗氧化劑。

圖6 蛇莓多酚與對照的抑制α-葡萄糖苷酶能力Fig.6 The a-glucosidase inhibitory activity of sample and control

圖7 蛇莓多酚與對照的抑制AChE能力Fig.7 The AChE inhibitory activity of sample and control

文章選擇以4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)為底物，通過測定其熒光強度變化的方法來評價樣品抑制α-葡萄糖苷酶的能力。相比常規(guī)以p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物的方法，4-MUG法的底物穩(wěn)定時間是pNPG法的2～3倍，且可用于測定溶解性不好、易出現(xiàn)渾濁的樣品，其結果靈敏、重現(xiàn)性好。實驗結果表明，蛇莓多酚具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶能力，且采用微波輔助提取方法得到的蛇莓多酚的抑制能力高于其他水提和常溫浸泡方法[20-23]。

乙酰膽堿酯酶活力抑制實驗結果表明，蛇莓多酚具有較好的抑制乙酰膽堿酯酶能力，但其抑制能力和他人報道的結果較為相近[20]，因此，不同提取方法對其抑制乙酰膽堿酯酶的能力影響不大。

4 結 論

微波輔助提取適用于蛇莓中有效成分的提取，以總酚得率為考察指標，最佳提取條件為甲醇體積分數(shù)67 %，料液質量體積比1︰18，微波功率280 w，微波時間為112 s，在此條件下蛇莓多酚的提取率為5.21 %±0.16 %。蛇莓多酚具有較強的體外抗氧化活性，其清除DPPH自由基的IC50值為(8.63±0.4)μg/mL，清除ABTS+自由基的IC50值為(32.11±1.48)μg/mL，鐵還原能力為(2190.32±6.46)μg FeSO4/mg。蛇莓多酚抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值為(223.89±51.07)μg/mL，低于標準對照物阿卡波糖。抑制乙酰膽堿酯酶能力的IC50值為202.95 μg/mL，可開發(fā)為天然抗氧化劑和降血糖、防治老年癡呆藥物。