王佩佩，楊 華，戴賢君，桂國弘，肖英平，*

(1.中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

雞肉作為世界上最主要的肉食消費(fèi)品之一，具有高蛋白、低膽固醇、低脂肪的營養(yǎng)特點(diǎn)，受到人們的喜愛。我國為全球第二大肉雞消費(fèi)國，僅次于美國[1-3]。為保障公共衛(wèi)生安全，目前我國多城市已禁止活禽交易，實(shí)行家禽定點(diǎn)屠宰[4]。然而肉雞在屠宰加工過程易受到微生物的污染，如各屠宰區(qū)域的水、屠宰設(shè)備中微生物的交叉污染而增加雞肉的微生物污染水平[5]。屠宰場環(huán)境中存在的腐敗菌可影響雞肉品質(zhì)和貨架壽命，一些特定病原菌也對人類健康造成威脅[6]。肉雞在屠宰過程中產(chǎn)生的廢棄物含有血、毛、糞便等直接污染屠宰場區(qū)域的水體和地面，其含有一定量的病原菌，有些病原菌甚至攜帶耐藥基因等，可能會污染周邊水體和土壤。因此，家禽屠宰場的微生物分布狀況不僅直接影響雞肉的質(zhì)量安全，也關(guān)系到生態(tài)環(huán)境和人類健康。目前，國內(nèi)對肉雞的屠宰加工過程中特定食源性致病菌的研究較多，如James等[7]發(fā)現(xiàn)，肉雞屠宰加工生產(chǎn)鏈中存在單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、沙門氏菌、糞便梭菌等病原微生物，但對易造成雞肉微生物交叉污染的家禽屠宰場區(qū)域水體、地面以及屠宰器械表面微生物結(jié)構(gòu)和耐藥基因研究較少。本研究采用基于16S rRNAV3-V4的Illumina 高通量測序方法分析家禽屠宰場不同區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物結(jié)構(gòu)特征，以及通過PCR技術(shù)檢測微生物所攜帶的磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺類基因等9大類24種耐藥基因，為全面而準(zhǔn)確地認(rèn)識家禽屠宰場環(huán)境微生物多樣性、耐藥基因傳播擴(kuò)散與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣方法

1.1.1 屠宰區(qū)域水體微生物樣品采樣

選擇浙江省某屠宰場，屠宰區(qū)域主要包括掛禽間、宰殺瀝血間、浸燙間、脫毛間、凈膛間(包括凈膛和清洗)，分別用5 mL無菌槍頭吸取30 mL的地面水或器械水到無菌離心管中，4 ℃保存。樣品編號為宰殺瀝血間地表水(WSl)、浸燙間浸燙水(WScM)、浸燙間地表水(WSc)、脫毛間地表水(WD)、清洗間地表水(WC)、凈膛間地表水(WE)、凈膛后清洗水(WCE)、干凈屠宰用水(WU)。

1.1.2 地面和屠宰器械表面微生物樣品采樣

將7.5 cm×7.5 cm的紗布在無菌生理鹽水中沾濕，均勻擦拭屠宰場各個(gè)加工區(qū)域中地面以及與雞肉直接接觸掛鉤、操作臺或傳送帶，最后放置到盛有生理鹽水的無菌離心管中，4 ℃保存。樣品編號為掛禽間地表面紗布(SFH)、宰殺瀝血間掛鉤表面紗布(SHSl)、宰殺瀝血間地表面紗布(SFSl)、浸燙機(jī)器面紗布(SScM)、浸燙間地表面紗布(SFSc)、脫毛機(jī)器表面紗布(SDM)、脫毛間地表面紗布(SFD)、清洗間傳送帶表面紗布(SBc)、凈膛間掛鉤表面紗布(SHE)、凈膛間桌面紗布(STE)。

1.2 樣品處理和細(xì)菌基因組DNA提取

將屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品按照ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)提取總細(xì)菌DNA。具體操作：將紗布擦拭微生物樣品置于搖床振蕩30 min，然后離心機(jī)離心10 min，去除上清液；采集水樣直接離心將沉淀重懸于200 μL無菌生理鹽水后，加入ZR BashingBead Lysis Tube，按照試劑盒說明書提取DNA，進(jìn)行電泳檢測。

1.3 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)從9類抗生素耐藥基因中共選取了24種耐藥基因，包括2種磺胺類基因(sulⅠ、sulⅡ)，5種喹諾酮類基因(qnrA、qnrD、qnrS、qepA和oqxB)，4種四環(huán)素類基因(tetC、tetB、tetK和tetA)，3種氯霉素類基因(cmlA，floR和cfr)，3種大環(huán)內(nèi)酯類基因(ereA、ermB和mef)，2種β-內(nèi)酰胺類基因(blaTEM和blaCTX-M)，2種青霉素類基因(mecA和mecC)，1種氨基糖苷類基因(aadA1)，2種多粘菌素類基因(pmrA和pmrB)。所用引物見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min預(yù)變性；然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)；最后16 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并成像。

1.4 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

以提取的DNA為模板，擴(kuò)增環(huán)境細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)，引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。通過QIIME 軟件對獲取的序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾，采用ucluster方法根據(jù)相似性≥97%原則將通過質(zhì)控的有效序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU[24])。通過繪制稀釋曲線(rarefaction curve)評價(jià)所測序量是否覆蓋全部類群。采用QIIME默認(rèn)參數(shù)計(jì)算各樣品的alpha多樣性指數(shù)(ChaoⅠ、ACE、Simpson、Shannon和Coverage指數(shù))，以及Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫對所有OTU的代表性序列進(jìn)行物種匹配，分別在門和屬的水平上對樣品的細(xì)菌組成進(jìn)行菌群統(tǒng)計(jì)，并繪制柱狀圖。根據(jù)各個(gè)樣品OTU的種類及其豐度，計(jì)算樣品的加權(quán)UniFrac距離，再對18個(gè)樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。

表1 PCR反應(yīng)引物

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品微生物物種豐富度及多樣性

經(jīng)過質(zhì)控、過濾、拼接等處理，本實(shí)驗(yàn)最終獲得902 029條有效序列，其中屠宰區(qū)域水體樣品(W)有392 394條有效序列，屠宰器械表面微生物樣品(S)有509 635條有效序列。所獲得的有效序列根據(jù)97%相似性水平進(jìn)行OTU聚類分析，各樣品最終獲得517～810個(gè)OTU，各樣品的覆蓋度指數(shù)(goods coverage)均為0.994～1.000，表明樣本中序列沒有被測出的概率極低，因此本次測序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)多樣性組成。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩(圖1)，說明測序已趨于飽和，測序深度已基本覆蓋樣品中所有的物種。進(jìn)一步使用ChaoⅠ指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對樣本內(nèi)細(xì)菌群落的豐富度和多樣性進(jìn)行評估(表2)。

表2 樣品測序概況

WSl，宰殺瀝血間地表水；WSc，浸燙間地表水；WD，脫毛間地表水；WC，清洗間地表水；WE，凈膛間地表水；WScM，浸燙水；WCE，凈膛后清洗水；WU，干凈屠宰用水；SFH，掛禽間地表面紗布；SFSl，宰殺瀝血間地表面紗布；SFSc，浸燙間地表面紗布；SFD，脫毛間地表面紗布；SHSl，宰殺瀝血間掛鉤表面紗布；SHE，凈膛間掛鉤表面紗布；SScM，浸燙機(jī)器表面紗布；SDM，脫毛機(jī)器表面紗布；SBC，清洗間傳送帶表面紗布；STE，凈膛桌面表面紗布。下同。

WSl， water from slitting and blood draining district; WSc， water from scalding district; WD， water from dehairng district; WC， water from cleaning district ; WE， water form eviscerating district; WScM， water from scalding machine; WCE， water after cleaning the carcass in evisceration district; WU， water used in this slaughter house; SFH， surface swabs of floor in hanging district; SFSl， surface swabs of floor in slitting and blood draining district; SFSc， surface swabs of floor in scalding district; SFD， surface swabs of floor in dehairng district; SHSl， surface swabs of hanger in scalding district; SHE， surface swabs of hanger in eviscerating district; SScM， surface swabs of scalding machine; SDM， surface swabs of dehair machine; SBC， surface swabs of belt in clean district; STE， surface swabs of table for evisceration. The same as below.

圖1 各樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each sample

2.2 屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

將18個(gè)屠宰區(qū)域水體、地面與屠宰器械表面微生物樣品用于細(xì)菌結(jié)構(gòu)測序分析，獲得的OTU分別在門和屬水平上進(jìn)行物種注釋，具體結(jié)果見圖2。可以看出在門的水平上，屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物主要分屬于9個(gè)門，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度分別為27.55%～88.99%、3.45%～59.78%和4.35%～31.78%，三者共同構(gòu)成了屠宰場區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面細(xì)菌菌群的主要結(jié)構(gòu)。

從在屬的水平上分析，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、棲熱菌屬(Thermus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)為主要菌屬，約占總菌群的46%以上；還有少量的考克氏菌屬(Kocuria)、副球菌屬(Paracoccus)，(Methylotenera)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、弓形桿菌屬(Arcobacter)。其中不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)在屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面的相對豐度分別為4.71%～24.27%，4.71%～24.27%，6.99%～42.67%。各樣品豐度較高的前35種菌屬見圖3。

圖2 各樣品在門(A)和屬(B)水平上豐度較高的前10菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 The top 10 phyla (A) and genera (B) of each sample

假單胞菌屬是典型的腐敗菌，因其營養(yǎng)要求低，黏附力強(qiáng)，極易在低溫潮濕的環(huán)境中繁殖，其生長代謝能加速禽肉的腐敗[25]。在臨床上假單胞菌可感染人體皮膚、呼吸道、泌尿道、胃腸道等，是醫(yī)院感染常見的病原菌。此外不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬和希瓦氏菌屬在低溫潮濕環(huán)境下也能快速繁殖，是禽肉及水產(chǎn)品低溫保存過程中的常見腐敗菌[26-28]。不動(dòng)桿菌屬具有一定的致病性，屬于條件致病菌，可引起肺部、傷口、皮膚和泌尿生殖系統(tǒng)感染，甚至?xí)鹁Y、腦膜炎等臨床疾病[30]。假單胞菌屬在凈膛后清洗水微生物中的相對豐度較高，達(dá)到24%之多。有相關(guān)研究表明假單菌屬能耐受清洗水中的氯濃度而生存下來，其他菌屬會因?yàn)橐志镔|(zhì)的存在而相對減少[31]。這些條件致病菌和腐敗菌廣泛存在于屠宰場區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面中，可與屠宰加工的雞肉構(gòu)成交叉污染，致雞肉加速腐敗，還可能引起食源性疾病的發(fā)生。

2.3 樣品的聚類與主坐標(biāo)分析

根據(jù)各樣品OTU的種類及其豐度，計(jì)算樣品間的加權(quán)UniFrac距離，對18個(gè)屠宰區(qū)域水體與屠宰器械表面微生物樣品進(jìn)行了主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)(圖4)。結(jié)果表明，同種樣品如屠宰區(qū)域水體微生物之間、屠宰場地面和屠宰器械表面微生物之間顯示出明顯聚集，而屠宰區(qū)域水體跟屠宰場地面和屠宰器械表面微生物之間相距較遠(yuǎn)，與圖3的菌群豐度熱點(diǎn)圖相類似。

圖3 家禽屠宰場不同區(qū)域菌屬熱點(diǎn)圖和聚類分析Fig.3 Heatmaps and dendrograms of the most abundant bacterial genera in different area of poultry slaughterhouse

圖4 各樣品細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal coordiante analysis (PCoA) of the dissimilarity between the bacterial samples

2.4 屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品的耐藥基因檢測結(jié)果

通過對18個(gè)屠宰區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物樣品中的9大類抗生素24種耐藥基因的PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，21種耐藥基因分布在這些樣品中。由此可見屠宰場的耐藥基因檢出率很高，其中sulⅠ、sulⅡ和qnrS的檢出率為100%，blaTEM、tetB和aadA1的檢出率為94.4%，floR和mecC的檢出率為88.9%(表3和表4)。但是在干凈屠宰用水(WU)中只檢測出sulⅠ、sulⅡ、qnrS和tetA這4種耐藥基因，表明屠宰場區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物中的大多數(shù)耐藥基因不是來源于干凈的屠宰用水。

畜牧業(yè)中濫用抗生素會使有害菌種產(chǎn)生耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留，通過食物鏈進(jìn)入到人體中，對人類健康造成巨大的威脅[31-32]。環(huán)境中耐藥微生物促進(jìn)了耐藥致病菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散，抗生素耐藥基因作為一種環(huán)境中難以去除的新型污染物，具有可遺傳性和可轉(zhuǎn)移性[33-34]。家禽屠宰場環(huán)境中存在21種耐藥基因之多，屠宰場的的水體、地面和屠宰器械表面存在的耐藥基因有些許差異，tetK和pmrB基因只分布在屠宰場器械表面，cmlA、mef和tetC基因只存在于屠宰場區(qū)域水體中。一旦肉雞在屠宰加工生產(chǎn)鏈中受到處理水、屠宰器械的微生物交叉污染，這些耐藥基因極有可能會移轉(zhuǎn)到雞肉上。人們通過消費(fèi)食用這些受耐藥基因污染的雞肉，耐藥基因隨之進(jìn)入人體中。此外含有耐藥基因的屠宰場廢棄物若不經(jīng)過處理直接排放，還有可能會污染地下水和增加土壤的微生物耐藥性。本文在定性水平上展示了耐藥基因在屠宰場的分布狀況，屠宰場對耐藥基因的傳播起到了推進(jìn)作用，對人類健康和生態(tài)環(huán)境存在著一定的危害。

表3 屠宰場不同區(qū)域水體中微生物耐藥基因PCR檢測結(jié)果

+，檢出；-，未檢出。下同。

+， Detected; -， Undetected. The same as below.

表4 屠宰場地面和器械表面微生物耐藥基因PCR檢測結(jié)果

3 討論

James等[7]發(fā)現(xiàn)肉雞屠宰加工生產(chǎn)鏈中存在單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、沙門氏菌、糞便梭菌等病原微生物；樊靜等[6]發(fā)現(xiàn)屠宰場環(huán)境中存在的腐敗菌可影響雞肉品質(zhì)和貨架壽命，但對易造成雞肉微生物交叉污染的家禽屠宰場區(qū)域水體、地面以及屠宰器械表面微生物結(jié)構(gòu)和耐藥基因研究較少。本文通過Illumina高通量測序技術(shù)對家禽屠宰場區(qū)域水體、地面和屠宰器械表面微生物的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在門的水平上以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)為主；在屬的水平上主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、棲熱菌屬(Thermus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和希瓦氏菌屬(Shewanella)。從定性水平上展示耐藥基因在屠宰場的分布狀況來看，屠宰場環(huán)境中存在21種耐藥基因，其中8種耐藥基因的檢出率為88.9%以上。由此反映出屠宰場不同區(qū)域的水體、地面和屠宰器械表面存在種類較多的耐藥基因，且存在一些條件性致病菌和腐敗菌，但耐藥基因各來自何種菌種需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。