曹鈺瑩，李 威，鐘志軍，肖 潔，弓 超，王承東，李才武，楊海迪，黃祥明，吳孔菊，*，彭廣能，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 2.中國大熊貓保護(hù)研究中心臥龍基地，四川 阿壩 624000； 3.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都 610081)

畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單核真核生物，是一種重要的人畜共患病原體。它可以導(dǎo)致免疫缺陷者發(fā)生脫水性致命性的腹瀉，也會(huì)導(dǎo)致免疫力正常動(dòng)物的自限性腹瀉。畢氏腸微孢子蟲屬真菌界(Fungi)，微孢子蟲門(Microsporidia)，無膜泛成孢子蟲亞目(Apansporoblastina)，腸孢子蟲科(Enterocy-tozoonidae)，腸孢子蟲屬(Enterocytozoon)[1-2]。畢氏腸微孢子蟲(E.bieneusi)在自然界分布廣泛，從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物乃至人中均有發(fā)現(xiàn)[3]，其孢子也廣泛存在于水源中。美國環(huán)境保護(hù)協(xié)會(huì)(EPA)將其列為能夠?qū)е滤葱员┌l(fā)流行的微生物類污染物，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)將其列為B類生物防范病原體[4]。

畢氏腸微孢子蟲核糖體RNA(rRNA)基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)具有高度的多樣性，可被用于E.bieneusi的基因分型[5]。目前，根據(jù)畢氏腸微孢子蟲(E.bieneusi)的ITS基因型，將其劃分為8個(gè)組(group 1～group 8)，其中g(shù)roup 1中的基因型能夠感染人和動(dòng)物[6]。

大熊貓是我國重要的保護(hù)動(dòng)物。據(jù)第4次大熊貓普查的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，目前，我國存活的大熊貓僅有2 239只，其中，野生大熊貓1 864只，圈養(yǎng)大熊貓375只[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，繁殖力低下、棲息地減少及食物缺乏等因素是造成大熊貓數(shù)量稀少的主要原因，除此之外，寄生蟲的高感染率也嚴(yán)重威脅著大熊貓的生存，現(xiàn)已成為大熊貓保護(hù)工作不可忽視的重要內(nèi)容[8]。本研究采用巢氏PCR基于ITS基因擴(kuò)增樣品DNA，對(duì)國內(nèi)10個(gè)省(市、自治區(qū))動(dòng)物園內(nèi)的大熊貓進(jìn)行畢氏腸微孢子蟲流行病學(xué)調(diào)查，為圈養(yǎng)大熊貓畢氏腸微孢子蟲病的防控奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

本研究于2017年采集國內(nèi)江蘇、福建、浙江等10個(gè)省(市、自治區(qū))的動(dòng)物園內(nèi)圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞便共計(jì)31份。將采集的新鮮糞便分別置于密封袋中，相應(yīng)標(biāo)記并編號(hào)，并放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

糞便DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司。2×TaqPCR Master Mix 購自天根生化科技(北京)有限公司。DL2000 DNA Marker、BSA均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 糞便DNA提取

取200 mg糞便于2 mL離心管中，按照DNA提取試劑盒的步驟進(jìn)行大熊貓糞便的提取。將提取的DNA分裝，一部分保存于4 ℃待檢，另一部分保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 巢氏PCR

將提取的DNA進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增其ITS基因，引物及退火溫度參考Sulaiman等[9]的文獻(xiàn)，詳細(xì)見表1。擴(kuò)增體系均為25 μL，其中2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，去離子水7.5 μL，0.1% BSA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL。

1.5 產(chǎn)物檢測及測序

取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，將其點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠孔中，在130 V電壓下電泳1 h，然后于電泳凝膠成像系統(tǒng)儀中拍照。將出現(xiàn)的與目的條帶一致的擴(kuò)增產(chǎn)物送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST比對(duì)校正后提交至NCBI，獲得登錄號(hào)。

1.6 序列分析及種系發(fā)育分析

從NCBI分別下載ITS位點(diǎn)相關(guān)序列，用Clustal X(1.83)按照默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行比對(duì)，然后用MEGA 6.06軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

F1， 第一套上游引物； R1， 第一套下游引物； F2， 第二套上游引物； R2， 第二套下游引物。

F1， The first set of upstream primers; R1， The first set of downstream primers; F2， The second set of upstream primers; R2， The second set of downstream primers.

2 結(jié)果與分析

2.1 大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染情況

PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)的31份大熊貓新鮮糞便中，畢氏腸微孢子蟲陽性共14份，總感染率45.2%，其中雌性大熊貓感染率為50%(6/12)，雄性大熊貓感染率為42.1%(8/19)(表2)，不同性別的大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率無顯著差異(P>0.05)。亞成體(年齡在1.5～5.5歲)大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率為100%(1/1)；成體(年齡>5.5歲)的大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率為43.3%(13/30)(表2)。在此次的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)省份的動(dòng)物園圈養(yǎng)大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率為100%(表3)，另有3個(gè)省份的感染率為0，有2個(gè)省份的感染率為50%，剩余的感染率分別為67.7%和33.3%(表3)。

2.2 ITS基因型及種系發(fā)育分析

對(duì)畢氏腸微孢子蟲陽性分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，發(fā)現(xiàn)了2種感染大熊貓的畢氏腸微孢子蟲基因型，分別為SC02(n=13)(GenBank登錄號(hào)：KY950533)和Peru6(n=1)(GenBank登錄號(hào)：KY950540)，其中，基因型Peru6來自于成都動(dòng)物園內(nèi)的感染大熊貓。基于ITS序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹(圖1)表明，SC02與Peru6均屬于group 1b，具有人畜共患潛能。

3 討論

近年來，由于對(duì)畢氏腸微孢子蟲的研究逐漸增多，在器官移植受者、兒童、老年人和惡性疾病與糖尿病患者等人群中發(fā)現(xiàn)了若干例感染的情況[10]。隨著對(duì)畢氏腸微孢子蟲研究的逐漸深入，畢氏腸微孢子蟲也越來越多地在家畜以及野生動(dòng)物上被發(fā)現(xiàn)。

本次調(diào)查的圈養(yǎng)大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率為45.2%，是此前Tian等[11]在陜西秦嶺野生動(dòng)物園等的大熊貓上發(fā)現(xiàn)的畢氏腸微孢子蟲感基因型括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為樣品數(shù)。

表2 不同年齡及性別的圈養(yǎng)大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率及基因型

The values in brackets are sample numbers of the corresponding genotype

圖1 大熊貓?jiān)串吺夏c微孢子蟲ITS基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic relationships of ITS nucleotide sequences of the Enterocytozoon bieneusi in giant panda

染率(8.7%，4/46)的5倍；而Deng等[12]在中國西南地區(qū)5個(gè)動(dòng)物園內(nèi)亞洲黑熊上發(fā)現(xiàn)的畢氏腸微孢子蟲感染率為27.4%(29/106)，低于此次實(shí)驗(yàn)所得感染率。造成感染率差距如此大的原因可能與動(dòng)物的種類、身體狀況、年齡大小，以及其飼養(yǎng)密度等有關(guān)。在對(duì)比各地動(dòng)物園大熊貓的畢氏腸微孢子蟲感染率后發(fā)現(xiàn)，此次實(shí)驗(yàn)中沿海地區(qū)的動(dòng)物園感染率較高，如廣東、福建、上海等(表3)，這可能與地理位置及氣候有關(guān)。從表3還可以看出，在感染率100%的動(dòng)物園內(nèi)發(fā)現(xiàn)的畢氏腸微孢子蟲陽性分離株的基因型均為SC02(如廣東、湖南)，而大多數(shù)只存在一只大熊貓的動(dòng)物園內(nèi)畢氏腸微孢子蟲感染率為0，因此，也可能存在動(dòng)物園內(nèi)大熊貓交叉感染的可能性。另外，高感染率還可能與大熊貓“搬家”造成的應(yīng)激有關(guān)：這些都需要再進(jìn)一步研究。此外，在本研究中不同性別及年齡的大熊貓的畢氏腸微孢子蟲感染率無顯著差異。

本實(shí)驗(yàn)檢測到的圈養(yǎng)大熊貓畢氏腸微孢子蟲優(yōu)勢基因型SC02(92.6%，13/14)，SC02基因型是2016年Li等[13]從圈養(yǎng)西藏棕熊、北方浣熊等熊科動(dòng)物上發(fā)現(xiàn)并命名的畢氏腸微孢子蟲新基因型，根據(jù)Li等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，基因型SC02與感染人的基因型R同屬于畢氏腸微孢子蟲的ITS基因分組中g(shù)roup 1的1b，具有潛在的人畜共患可能性，目前已經(jīng)在中國人群發(fā)現(xiàn)(GenBank登錄號(hào)KY465443)。另外，該基因型也在亞洲黑熊、月熊等熊科動(dòng)物和馬中被發(fā)現(xiàn)[12,14]。SC02基因型首次在大熊貓中鑒定到，拓寬了該基因型的宿主范圍。在本次實(shí)驗(yàn)中鑒定到的畢氏腸微孢子蟲基因型Peru6之前也在成都動(dòng)物園中的一只大熊貓中鑒定到，該基因型除了在大熊貓上被發(fā)現(xiàn)，之前也在鳥類、犬、牛等動(dòng)物，以及人上有過報(bào)道[1,5,13,15]。有研究證明，基因型Peru6屬于group 1中的1b[16]，具有人畜共患特性。

本實(shí)驗(yàn)利用ITS基因位點(diǎn)對(duì)圈養(yǎng)大熊貓畢氏腸微孢子蟲的感染情況進(jìn)行調(diào)查，并開展了遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)感染大熊貓的2種畢氏腸微孢子蟲基因型(SC02和Peru6)皆屬于group 1，具有潛在的人畜共患可能性。SC02基因型是第一次在大熊貓上被發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)大了SC02的宿主范圍。由于圈養(yǎng)大熊貓與人類接觸頻繁，增加了大熊貓?jiān)串吺夏c微孢子蟲感染人的可能性。