胡能兵，龐丹丹，隋益虎，舒英杰，何克勤，朱小妹

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科多年生的蔬菜作物，原產(chǎn)中南美洲，現(xiàn)已成為一種世界的蔬菜。當(dāng)前，我國的種植面積居世界第一，尤其在四川、重慶、湖南、江西、安徽等長江中下游地區(qū)廣泛種植和消費(fèi)[1-2]。辣椒喜溫不耐熱，超過35 ℃的高溫往往會對其生長造成不可逆的生理性傷害[3-4]。以中國內(nèi)陸為例，炎夏高溫往往具有作用時(shí)間長、影響范圍廣、持續(xù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，會嚴(yán)重影響全國絕大部分地區(qū)的蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)[5]。上述高溫脅迫問題可通過選育抗(耐)高溫新品種、優(yōu)化栽培措施(如覆蓋遮陽網(wǎng)、合理疏植、勤澆水)等方式予以部分或全部解決。

目前，關(guān)于不同脅迫對植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，前人已有些研究[6-9]。作為一種探測和分析植物光合效率的新技術(shù)，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)為研究PSⅡ及光合電子傳遞提供了可靠的信息依據(jù)，是研究植物逆境脅迫的理想探針[10]。為此，在前人的研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬通過設(shè)定38 ℃的高溫脅迫，采用熱害指標(biāo)直接觀察法和熒光參數(shù)分析法等兩種不同的脅迫考察方式，以期綜合選育出抗(耐)高溫新品種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料由安徽科技學(xué)院辣椒課題組選育，具體見表1。用于模擬高溫逆境的儀器為廣東韶關(guān)市科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的PYX-250G-A光照培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)于2016年4月在安徽科技學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。待辣椒進(jìn)入生殖生長期，取主莖分支處葉片用于實(shí)驗(yàn)。首先準(zhǔn)備42個(gè)培養(yǎng)瓶，裝滿清水，選擇每個(gè)組合共隨機(jī)選取21個(gè)生長健壯的葉片，重復(fù)3次。稱重后均勻地分插在3個(gè)瓶中。置于光周期12 h、38 ℃高溫條件下進(jìn)行處理。高溫處理后，每24 h觀察一次并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在鑒定期間，每天檢查培養(yǎng)瓶中水位并及時(shí)補(bǔ)加清水，每次觀察后將培養(yǎng)箱中上下實(shí)驗(yàn)材料顛換一次，盡量減少誤差。

1.3 數(shù)據(jù)測定

1.3.1 熱害指數(shù)的測定

實(shí)驗(yàn)借鑒了辣椒離體葉片耐熱性鑒定體系[11]，將熱害指數(shù)分為6個(gè)等級，分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級—全葉青綠，無熱害癥狀；1級—葉片失水，輕度萎蔫；3級—葉片輕度失綠，輕度萎蔫；5級—葉片總體偏黃，萎蔫，葉尖部分壞死；7級—全葉偏黃，葉尖壞死，葉緣翻卷；9級—全葉發(fā)黃，葉尖葉緣壞死焦枯，葉緣翻卷。

1.3.2 熱害指數(shù)和失水率的計(jì)算方法

熱害指數(shù)和失水率的計(jì)算方法見文獻(xiàn)[11-12]。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

采用Yaxin-1161G葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測定前先用葉夾使葉片暗適應(yīng)30 min，接著按順序分別取下帶有夾子的待測葉片，將其進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析。每個(gè)處理測定3個(gè)葉片，3次重復(fù)。測定完畢進(jìn)行標(biāo)記，下一次測量仍然選擇同一個(gè)葉片。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，方差分析時(shí)用于多重比較的方法為Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對辣椒熱害指數(shù)的影響

由表2可知，在較短高溫處理時(shí)間下(24 h)，材料11的熱害指數(shù)最高，為38.1%；而同期的材料6、2僅為4.23%，為前者的1/9；且材料11與其他12份辣椒雜交組合的熱害指數(shù)差異都達(dá)到顯著水平，與材料13、10的差異未達(dá)到極顯著水平。隨著高溫處理時(shí)間的延長，不同辣椒材料的熱害指數(shù)分別為7.94%～39.68% (48 h)、34.39%～77.78% (72 h)、42.39%～78.31% (96 h)，品種間的差異倍數(shù)隨之減小。在處理96 h，材料10、11、12之間并無顯著或極顯著差異，僅與材料6、1、7、2的差異達(dá)到極顯著水平。

表1 不同辣椒材料

表2 高溫不同時(shí)間處理對辣椒熱害指數(shù)的影響

2.2高溫脅迫對辣椒失水率的影響

失水率是另一個(gè)直觀反映高溫脅迫對植物傷害的影響因素，失水率的高低表明不同材料的辣椒種質(zhì)應(yīng)對高溫脅迫和保持水分的能力。由表3可知，失水率高的材料分別為品種10、11、12、13，而失水率低的材料為品種1、2等。方差分析結(jié)果表明，品種10、11、12、13與品種1、2在高溫處理24 h差異達(dá)到顯著水平，但該4種材料之間無顯著性差異；高溫處理96 h，品種8、10、11與品種1、2、7差異達(dá)到顯著水平，而品種8與品種1、2、7的差異達(dá)到極顯著水平。

表3 高溫不同時(shí)間處理對辣椒失水率的影響

2.3 利用熱害指標(biāo)的辣椒組合綜合評分

為充分了解14種辣椒對高溫的持續(xù)抵抗能力，本實(shí)驗(yàn)選取最后兩個(gè)時(shí)間段進(jìn)行綜合評分。由于熱害指數(shù)和失水率的數(shù)值越高，材料對高溫的抵抗能力越差，因而其隸屬度越小，其中熱害指標(biāo)數(shù)值最小的隸屬度為1，數(shù)值最大的隸屬度為0。采用模糊綜合評判法計(jì)算上述2個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；在權(quán)重賦值上，熱害指數(shù)更直觀地反映了辣椒材料受傷害程度，這種傷害在短時(shí)間內(nèi)可能無法通過復(fù)水予以恢復(fù)，而失水率僅表現(xiàn)為葉片質(zhì)量的減輕，無法確定葉片受傷害的程度，因而將熱害指數(shù)權(quán)重確定為0.3，失水率權(quán)重設(shè)定為0.2。由表4可知，品種2的綜合評分最高，在2個(gè)不同時(shí)間段的4次評分指標(biāo)中，有2次的隸屬度為1，還有1次是0.99；接下來依次是品種7、1、6；而不耐高溫的分別是品種10、11和13、12。

2.4 高溫脅迫對辣椒葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fo的影響

由表5可知，隨著處理時(shí)間的延長，14種辣椒材料的Fo變化趨勢分為三類，具體為：11份辣椒材料隨著處理時(shí)間的延長呈緩慢上升的趨勢，說明高溫脅迫會導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心被持續(xù)破壞；而材料2、9則表現(xiàn)為先升后降再升的趨勢，其中在24～48 h，F(xiàn)o急速上升，而在48～72 h則急速下降，表明盡管高溫脅迫會短時(shí)間內(nèi)破壞PSⅡ反應(yīng)中心，但通過天線色素?zé)岷哪艿脑黾?，其Fo會降低，使其逐步適應(yīng)高溫脅迫。

2.5 高溫脅迫對辣椒葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的影響

在植物正常生理?xiàng)l件下，其潛在的PSⅡ光化學(xué)效率Fv/Fm變化很小，而逆境條件下該參數(shù)則會明顯降低。由表6可知，14份辣椒材料隨著脅迫時(shí)間的增加，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。當(dāng)高溫處理24 h，只有品種3、4間的Fv/Fm表現(xiàn)為顯著性差異，但未達(dá)到極顯著水平；而當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到96 h，品種6與品種4、10之間差異達(dá)到顯著性水平，與品種11、8的Fv/Fm差異達(dá)到極顯著水平。為了更好地區(qū)分不同辣椒的耐熱性能，實(shí)驗(yàn)比較了24～96 h植物Fv/Fm的下降幅度，其中，6號材料在高溫脅迫4 d后的降幅最低，僅為6.92%，其次為2號、13號和1號材料。位居后4位的不耐高溫材料分別為11、5、10和8。上述結(jié)論說明，本實(shí)驗(yàn)的高溫逆境脅迫下，植物的PSⅡ反應(yīng)中心被持續(xù)破壞，從而導(dǎo)致其潛在的PSⅡ光化學(xué)效率降低。隨著處理時(shí)間的延長，不同辣椒種質(zhì)對高溫脅迫的響應(yīng)存在差異，表現(xiàn)為各種質(zhì)的Fv/Fm之間的差異更為顯著，這也為利用該參數(shù)對耐熱辣椒種質(zhì)的篩選提供了條件。

表4 高溫脅迫下不同辣椒的綜合評分

表5 高溫不同時(shí)間處理對辣椒Fo的影響

表6 高溫不同時(shí)間處理對辣椒Fv/Fm的影響

3 討論

3.1 高溫脅迫對辣椒熱害指標(biāo)的影響

辣椒是喜溫不耐熱的蔬菜作物，研究表明，辣椒適宜的溫度范圍是白天25 ℃、夜間18 ℃左右[13]。而超過35 ℃的高溫會導(dǎo)致辣椒生長發(fā)育出現(xiàn)一系列的障礙，如植株形態(tài)矮小，葉片顏色變淡，畸形花和畸形果、病果等增多的現(xiàn)象[14]。潘寶貴等[15]研究表明，40 ℃的高溫脅迫處理12 h對所有品種凈光合速率(Pn)均產(chǎn)生明顯的抑制，而耐熱品種葉綠素總量變化幅度小于熱敏品種；韓笑冰等[16]則從辣椒花粉發(fā)育及生活力方面闡述了熱脅迫的影響，表明高溫脅迫下花粉、花藥發(fā)育過程出現(xiàn)異常，花粉萌發(fā)率下降，花粉管伸長停滯。

隨著全球化的“溫室效應(yīng)”越發(fā)地嚴(yán)重，除了可以優(yōu)化栽培措施外，選育耐熱新品種是防治或減輕高溫脅迫的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)以14個(gè)辣椒雜交組合進(jìn)行熱害指標(biāo)的篩選，分別采用72和96 h的熱害指數(shù)和失水率為參考指標(biāo)，通過運(yùn)用隸屬度分析的方法得出1、2、6、7是較優(yōu)的組合。

值得一提的是，之前多位研究者在運(yùn)用隸屬度或隸屬函數(shù)對作物進(jìn)行綜合評價(jià)時(shí)，只是將不同評價(jià)指標(biāo)處理后的隸屬度進(jìn)行了簡單的相加，從而得出該作物的排名[17-18]。然而，筆者對上述排名方法提出異議。由于育種目標(biāo)的不同(產(chǎn)量、品質(zhì)或者抗逆性等)，各入選的指標(biāo)參數(shù)應(yīng)賦予不同的權(quán)重，從而不同指標(biāo)的隸屬度與權(quán)重乘積相加，才是其應(yīng)得的分?jǐn)?shù)和排名。本例中，通過傷害等級計(jì)算的熱害指數(shù)為最直接明了的一項(xiàng)影響因素，故賦予權(quán)重為0.3，在抗高溫育種中要高于權(quán)重為0.2的失水率指標(biāo)。

3.2 高溫脅迫對辣椒葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠體對光能的吸收主要有3個(gè)用途：光合作用、熱耗散的形式流失和以葉綠素?zé)晒獾男问街匦掳l(fā)射出來。由于PSⅡ?qū)τ诃h(huán)境因素變化的敏感性，葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)[19]。本實(shí)驗(yàn)通過測定高溫脅迫下，辣椒葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，力圖尋找判斷辣椒種質(zhì)的抗(耐)高溫性能的更為經(jīng)濟(jì)方便的方法。在上述葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，初始熒光(Fo)是指不參與PSⅡ反應(yīng)中心光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分，F(xiàn)o的增加表明PSⅡ反應(yīng)中心受到破壞或者可逆性失活[20]；而PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)則反映了PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)光能轉(zhuǎn)換效率的高低，代表光合機(jī)構(gòu)把吸收的光能用于化學(xué)反應(yīng)的最大效率[21]。

諸多研究表明，高溫脅迫會對植物的葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生影響，會使初始熒光參數(shù)Fo上升，但種質(zhì)類型不同、脅迫時(shí)間不同會有不同的結(jié)果，而對Fv/Fm影響的報(bào)道較為一致，即脅迫會使熒光參數(shù)Fv/Fm下降。為更好地對辣椒的耐熱性進(jìn)行比較，本實(shí)驗(yàn)以24和96 h之間的Fv/Fm下降幅度作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排名，得出最優(yōu)的雜交組合為6、2、13、1。

高溫處理會顯著提高辣椒的熱害指數(shù)和失水率，這兩個(gè)熱害指標(biāo)會隨著高溫處理時(shí)間的增加而增加，對其隸屬度分析表明耐高溫的雜交組合依次為：1、2、6和7；高溫對不同辣椒的Fo影響不一致，而對Fv/Fm的影響表現(xiàn)為隨著時(shí)間的延長都會降低，通過Fv/Fm分析得出的耐高溫辣椒雜交組合依次為：6、2、13、1。此外，通過熱害指標(biāo)和熒光參數(shù)Fv/Fm分析得出的不耐高溫的組合分別為：11、12、13、14和8、10、5、11。上述兩種評定方法中，排列前4位的共同雜交組合是3個(gè)，相同的比例達(dá)到75%，一方面說明入選的雜交組合2、6、1可作為耐高溫組合進(jìn)行育種研究，另一方面則表明兩種方法具有較為密切的相關(guān)性和準(zhǔn)確預(yù)測程度，任何一種都可用于抗高溫育種的實(shí)際應(yīng)用。