付勁蓉 孫立成 夏 莉 劉麗娟 黃賽花 韓 曉 周玉峰,2

哮喘是在遺傳易感背景下由過(guò)敏原和環(huán)境因素相互作用而引起的一種免疫炎癥性疾病[1]。近年來(lái)受環(huán)境污染的影響，哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2～4]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，PM2.5與哮喘發(fā)病率增加、癥狀加重及急診就診率上升相關(guān)，但PM2.5通過(guò)何種機(jī)制誘發(fā)和(或)加重哮喘尚不清楚[5,6]。Th9細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，是在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及IL-4聯(lián)合刺激下分化而來(lái)，以分泌大量IL-9為主要特點(diǎn)，與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7,8]。本研究利用蟑螂提取物(CRE)建立過(guò)敏原致敏的小鼠哮喘模型，以此模型進(jìn)一步研究PM2.5暴露對(duì)小鼠氣道炎癥、支氣管高反應(yīng)性、Th9細(xì)胞的影響，為闡明環(huán)境污染與哮喘發(fā)作的關(guān)系及哮喘的防治提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雌鼠，6～8周齡，體重18～20 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)在復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級(jí)環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)方案得到了復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 PM2.5采集 ZR-3930型環(huán)境空氣顆粒物采樣器(青島眾瑞智能儀器公司)置于我院科研樓頂樓，連續(xù)采集2017年10～12月份的大氣PM2.5。將采有PM2.5的石英膜裁剪為1 cm×3 cm大小，浸入三蒸水中超聲振蕩1 h。用70 μm的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾振蕩液，濾液冷凍真空干燥，滅菌，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 哮喘小鼠模型的建立方法 采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)表的方案[9]：將20 μg CRE(購(gòu)自美國(guó) GREER Laboratories)于D0～D4氣管內(nèi)分別注射致敏5次(致敏階段)，D10～13氣管內(nèi)分別刺激4次(激發(fā)階段)，D14處死(圖1)。處死后收集肺泡灌洗液和肺組織備用。部分肺組織用于RNA和蛋白提取；部分肺組織用于HE染色，檢測(cè)肺組織的病理狀態(tài)。

圖1 小鼠哮喘模型建立方案

1.4 分組 激發(fā)階段在給予小鼠過(guò)敏原刺激的同時(shí)，采用氣管內(nèi)滴注的方法檢測(cè)PM2.5對(duì)小鼠哮喘發(fā)作的影響(圖1)[10～12]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本研究采用不同劑量PM2.5(25、50、100 μg)處理小鼠，發(fā)現(xiàn)PM2.5能明顯增強(qiáng)CRE誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，其中100 μg PM2.5作用最強(qiáng)，之后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)本研究均采用100 μg的PM2.5進(jìn)行處理。分組： ①PBS對(duì)照組：致敏和激發(fā)階段均采用50 μL PBS處理；②CRE組：致敏和激發(fā)階段均采用50 μL CRE(20μg)處理；③單用PM2.5組：致敏階段采用50 μL PBS處理，激發(fā)階段采用50 μL PM2.5(100 μg)處理；④PM2.5+CRE組：致敏階段采用50 μL CRE(20μg)處理，激發(fā)階段采用50 μL PM2.5(100 μg)和CRE(20μg)混合液處理。每次每組5只小鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 氣道高反應(yīng)性檢測(cè) 末次激發(fā)24 h后，采用戊巴比妥麻醉小鼠，行氣管插管，連接呼吸機(jī)和霧化裝置，用有創(chuàng)小鼠肺功能儀(美國(guó)Buxco公司)檢測(cè)不同分組小鼠的氣道反應(yīng)性。以乙酰甲膽堿(Mch)作為刺激劑，依次檢測(cè)0、6.25、12.5和25 mg·mL-1濃度的Mch引起小鼠氣道阻力和肺順應(yīng)性的變化，作為評(píng)價(jià)小鼠氣道阻力的指標(biāo)。

1.6 炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ)檢測(cè)不同分組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)[9]：嗜酸性粒細(xì)胞表型為side scatter (SSC)highSiglec-F+Mac-3-細(xì)胞, 肺泡巨噬細(xì)胞定義為 SSChighSiglec-F+Mac-3+細(xì)胞, 粒細(xì)胞定義為SSChighGr-1+細(xì)胞，淋巴細(xì)胞為 forward scatter(FSC)low/SSClowCD3+或CD19+。熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自美國(guó)e-Bioscience公司。

1.7 Th9比例檢測(cè) 取小鼠肺門淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，加入50 ng·mL-1PMA、1 μg·mL-1離子霉素和25 μM 布雷非德菌素A培養(yǎng)5 h。然后進(jìn)行CD3和CD4染色，再用BD 細(xì)胞固定/破膜試劑處理30 min，最后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IL-9染色。熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自美國(guó)e-Bioscience 公司。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同分組IL-9+細(xì)胞。

1.8 Th9細(xì)胞體外分化 用德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司的小鼠 幼稚CD4+T分離試劑盒分離幼稚T細(xì)胞。用anti-CD3和anti-CD28(2 μg·mL-1)包被96孔培養(yǎng)板，加入TGFβ(10 ng·mL-1)、重組鼠(rm)IL-2(10 ng·mL-1)、rmIL-4(10 ng·mL-1)和anti-IFNγ(10 μg·mL-1)分化培養(yǎng)4 d，部分細(xì)胞加入PM2.5(50 μg·mL-1)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-9+細(xì)胞比例或RT-PCR檢測(cè)IL-9表達(dá)。

1.9 RT-PCR檢測(cè) 采用德國(guó)QIAGEN公司RNeasy Mini Kit 提取RNA，采用隨機(jī)引物法合成cDNA，然后用SYBR Green(美國(guó)ABI公司)法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，采用β-actin 作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法[13]。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0或GraphPad Prism software 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)( %)來(lái)表示。符合正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；不符合正態(tài)分布或方差不齊的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣道高反應(yīng)性檢測(cè) 圖2顯示，CRE組與PBS組相比，氣道阻力增加[Mch 12.5 mg·mL-1：(2.372±0.289)vs(1.743±0.189) cmH2O·mL-1·s-1，P=0.002 1；Mch 25 mg·mL-1：(3.048±0.126)vs(2.209±0.118) cmH2O·mL-1·s-1，P=0.003 7)]，表明小鼠哮喘模型建立成功。CRE+PM2.5組與CRE組相比，小鼠氣道阻力增加[Mch 12.5 mg·mL-1：(3.028±0.116)vs(2.372±0.289) cmH2O·mL-1·s-1，P=0.040 9；Mch 25 mg·mL-1：(4.044±0.335)vs(3.048±0.126) cmH2O·mL-1·s-1，P=0.015 0)]。

圖2 氣道高反應(yīng)性檢測(cè)

注 1)：CRE組vsPBS組，P<0.05；2)：CRE組vsCRE+PM2.5組，P<0.01

2.2 PM2.5加重過(guò)敏性哮喘小鼠的肺部炎癥反應(yīng) CRE組與PBS組相比，小鼠肺部炎癥增強(qiáng)，表現(xiàn)為支氣管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3A，B)；支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增加(表1)。CRE+PM2.5組小鼠肺部炎癥明顯增強(qiáng)(圖3D)，與單用CRE組相比，支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，巨噬細(xì)胞改變不明顯(表1)。與PBS組比較，單用PM2.5組肺部病理改變及炎癥細(xì)胞數(shù)改變不明顯(圖3C，表1)。

圖3 肺組織病理切片HE染色

注 A：PBS組；B：CRE組；C：PM2.5組；D：PM2.5+CRE組

表1 小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

注 1)PBS組vsCRE組；2)CRE組vsPM2.5+CRE組

2.3 PM2.5在體內(nèi)促進(jìn)Th9細(xì)胞分化 圖4A顯示，采用熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織中IL-9的表達(dá)，結(jié)果顯示在小鼠哮喘模型中，CRE組較PBS組IL-9 mRNA轉(zhuǎn)錄明顯增加[(3.02±0.29)vs(1.0±0.07)，P=0.002 4]，PM2.5+CRE組較CRE組IL-9轉(zhuǎn)錄亦明顯增加[(5.95±0.67)vs(3.02±0.29)，P=0.016 1]；而單用PM2.5組IL-9轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯增加(P>0.05)。圖4B、C顯示,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺門淋巴結(jié)中Th9細(xì)胞數(shù)量，與熒光定量PCR結(jié)果一致，CRE組與PBS組[(4.85±0.53)%vs(0.80±0.11)%，P=0.001 7]，及PM2.5+CRE組與CRE組相比[(9.47±0.8)%vs(4.85±0.53)%，P=0.010 7]，肺門淋巴結(jié)Th9細(xì)胞分化明顯增加。

圖4 PM2.5在體內(nèi)促進(jìn)Th9細(xì)胞分化

注 A：采用qRT-PCR檢測(cè)肺組織中IL-9表達(dá)；B：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺門淋巴結(jié)中Th9細(xì)胞數(shù)量；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺門淋巴結(jié)Th9細(xì)胞(定量分析)；1)：CRE組vsPBS組，P<0.05； 2)：CRE組vsCRE+PM2.5組，P<0.05

2.4 PM2.5在體外可促進(jìn)Th9細(xì)胞分化 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5組IL-9陽(yáng)性細(xì)胞的比例[(52.0±5.8)%]高于PBS組[(31.7±3.2)%]，P=0.002 3(圖5)。進(jìn)一步用qPCR檢測(cè)IL-9的表達(dá)及調(diào)控Th9細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子水平，PM2.5可明顯促進(jìn)IL-9的轉(zhuǎn)錄[(3.16±0.18)vs(1.01±0.10)，P=0.008 7],以及Th9細(xì)胞分化調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PU.1[(2.16±0.18)vs(0.99±0.09)，P=0.027 2]和B細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄因子(BATF)的轉(zhuǎn)錄[(2.31±0.03)vs(1.01±0.10)，P=0.006 3]。

圖5 PM2.5在體外可促進(jìn)Th9細(xì)胞分化

3 討論

流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，PM2.5與哮喘發(fā)病率增加、癥狀加重及急診就診率上升相關(guān)，PM2.5每增長(zhǎng)10 μg·m-3，引起哮喘門診量上升2.0%，但其機(jī)制尚不清楚[5]。因此闡明PM2.5誘發(fā)及加重哮喘發(fā)作的具體機(jī)制，探尋防治策略，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。

本研究利用小鼠哮喘模型發(fā)現(xiàn)，PM2.5能明顯增強(qiáng)過(guò)敏原誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)為處理組小鼠的肺部炎癥明顯增強(qiáng)，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞明顯增加，肺組織中IL-9明顯增多，肺門淋巴結(jié)Th9細(xì)胞分化增加。Th9細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，是在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及IL-4聯(lián)合刺激下分化而來(lái)，分泌大量IL-9為其主要特點(diǎn)[8]。Th9細(xì)胞作為效應(yīng)性T細(xì)胞，在促進(jìn)組織炎癥發(fā)生的過(guò)程中起著重要作用。研究表明，Th9與哮喘的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系：Th9通過(guò)分泌IL-9直接作用于支氣管平滑肌引起氣道高反應(yīng)；Th9上調(diào)Th2細(xì)胞因子的分泌同時(shí)抑制Th1細(xì)胞因子的表達(dá)；Th9也可作用于氣道上皮細(xì)胞使之分泌過(guò)量的黏液和趨化因子，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的纖維化增生、平滑肌細(xì)胞的重構(gòu)[14～16]。此外，IL-9對(duì)多種炎癥調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞如B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等均具有重要的調(diào)節(jié)作用，如其可促進(jìn)B細(xì)胞免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生免疫球蛋白E(IgE)；可促進(jìn)肥大細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其表面高表達(dá)FcεRIa受體。此外，還可促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)多種趨化因子的分泌，從而招募大量炎癥細(xì)胞，加重氣道內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并可招募嗜酸性粒細(xì)胞以及促進(jìn)其成熟和抑制凋亡[7]。因此，我們認(rèn)為 PM2.5加重哮喘發(fā)作的一種重要機(jī)制為：通過(guò)增強(qiáng)肺內(nèi)Th9細(xì)胞分化，分泌IL-9，加重哮喘的發(fā)作。

至今，尚無(wú)研究發(fā)現(xiàn)Th9細(xì)胞分化的決定性轉(zhuǎn)錄因子，但研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子PU．1、BATF和IRF4對(duì)Th9的分化和功能具有重要作用[8,17～19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PM2.5可明顯上調(diào)Th9分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PU.1和BATF的表達(dá)，表明PM2.5可直接影響Th9細(xì)胞分化。但尚未解決的問(wèn)題是，PM2.5通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)Th9細(xì)胞分化。PM2.5的成分非常復(fù)雜，包括元素碳、有機(jī)碳化合物、硫酸鹽、硝酸鹽、銨鹽和重金屬等，在不同地區(qū)、不同污染源和不同氣象條件下差別迥異。為了驗(yàn)證PM2.5對(duì)Th9細(xì)胞分化的影響，本課題組還采用了由北京協(xié)和醫(yī)院提供的2016冬季收集的PM2.5，不同地區(qū)的PM2.5引起的炎癥反應(yīng)程度會(huì)有所差異，但對(duì)Th9分化的影響的趨勢(shì)是一致的。至于具體何種成分影響Th9分化，由于PM2.5成分復(fù)雜，目前解析到具體單一成分對(duì)Th9細(xì)胞的影響，尚有一定難度，但解析不同組分對(duì)Th9細(xì)胞分化的影響，對(duì)于尋找恰當(dāng)?shù)姆乐尾呗詫⒂幸欢ǖ闹笇?dǎo)意義。