黃春玲 余南嵐 熊亞 張東梅 楊希川

400038重慶，陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院皮膚科

毛乳頭位于毛囊底部的毛球中，是一種特殊的間質(zhì)成分，胚胎時期誘導毛囊發(fā)生發(fā)育，出生后在毛囊的周期性生長過程中起重要作用［1-3］。因此，體外分離培養(yǎng)毛乳頭細胞（dermal papilla cells，DPC）對于研究DPC的特性、生物學功能、毛囊發(fā)育與再生等均有重要意義［4-6］。不同部位DPC有各自的生物學特性［7-8］。目前已報道人頭皮、陰部和胎兒DPC，及大鼠觸須、背部DPC和西藏小型豬DPC的分離培養(yǎng)方法，尚無人腋窩DPC的高效快速分離方法的報道。我們改良建立一種簡單、高效、易操作且適合腋窩DPC分離培養(yǎng)的方法，并與一步酶消化法和顯微解剖法比較，為進一步研究毛囊提供細胞來源。

一、材料

1.主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），0.5%分離蛋白酶（Dispase）和0.2%Ⅰ型膠原酶（美國Sigma公司）。一抗鼠抗人層黏連蛋白單克隆抗體、Ⅳ型膠原多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），二抗3H-吲哚菁類染料（cy3）標記的羊抗鼠抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

2.標本來源及處理：標本來自2015年10月至2016年5月陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院皮膚科腋臭術(shù)后含毛囊的皮膚組織，大小為0.5 cm×2 cm～1 cm×4 cm，采集后立即置于4℃無菌D-hanks液中保存，保存時間＜24 h。將標本分為3組，分別用改良二步酶消化法、一步酶消化法、顯微解剖分離法分離毛乳頭，每組3份。

二、方法

1.標本消毒：將標本置于干凈培養(yǎng)皿中，放入75%乙醇浸泡2遍，每次5 min，用無菌D-hanks液漂洗5次后移入無菌培養(yǎng)皿中。

2.毛乳頭分離：3種方法操作過程比較見表1。

改良二步酶消化法［9］：①用鑷子去除多余的皮下脂肪組織，盡量去除毛囊單位周圍的組織，直至顯露毛球部，分離出單個毛囊，用眼科剪將毛球部剪下，將收集到的毛球轉(zhuǎn)入干凈的含有分離酶的培養(yǎng)皿中，4℃消化4～6 h，再37℃消化30 min；②將標本在D-hanks液中漂洗2遍后加入0.2%膠原酶37℃消化1.5～2 h，此后每30分鐘觀察毛乳頭游離情況，當有毛乳頭游出時立即加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM終止消化；③將液體移入離心管離心（2 000×g，5 min），棄上清液，沉淀即為毛乳頭、殘發(fā)、纖維組織及其他細胞的混合物，將沉淀移入平皿中用DMEM反復漂洗，倒置顯微鏡下將纖維組織和殘發(fā)及其余雜質(zhì)去掉。洗脫液繼續(xù)低速離心（500×g，3 min）4次，輕棄上清液，取沉淀加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

一步酶消化法：參照文獻［10］的方法分離。

顯微解剖分離法：參照文獻［11］的方法，用顯微解剖法得到完整毛乳頭，再加入Ⅰ型膠原酶（2 g/L，DMEM配制）37℃消化30 min后培養(yǎng)。

3.毛乳頭細胞培養(yǎng)：將通過3種分離方法獲得的毛乳頭用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。計算腋窩毛乳頭分離效率（分離出的毛乳頭個數(shù)/總毛囊數(shù)×100%）、貼壁率（貼壁毛乳頭個數(shù)/分離出的毛乳頭個數(shù)×100%），并觀察細胞遷出時間（從第1個毛乳頭有細胞遷出至所有毛乳頭不再有細胞遷出）。同時將改良二步酶消化法離心過程中的上清液進行培養(yǎng)。

4.毛乳頭細胞傳代：待細胞完全遷出后及時傳代，去掉原培養(yǎng)液，加入少量PBS中和殘余血清，移去中和液后再加入1 ml胰酶，室溫消化1～2 min，倒置顯微鏡下可見上層細胞變圓，底層細胞仍為長條形。再消化3 min，棄掉胰酶后加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，用吸管吹打至細胞完全脫落形成單細胞，可按1∶3比例傳代。

5.毛乳頭細胞鑒定：取第3代毛乳頭細胞，按每皿1×105個將細胞接種在激光共聚焦小皿上，37℃、5%CO2過夜培養(yǎng)，PBS沖洗2遍，4%甲醛室溫下固定10 min，PBS洗1遍，1%Triton100作用10 min，PBS緩沖液漂洗，山羊血清封閉20 min，棄去血清，滴加一抗，4℃冰箱過夜后PBS漂洗，滴加二抗，37℃下孵育20 min，PBS沖洗，RNase作用10 min，PBS漂洗，碘化丙錠復染核，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

三、結(jié)果

1.毛乳頭分離：上述3種方法分離得到的腋窩毛乳頭鏡下均呈錐形，大小與毛囊大小及直徑有關(guān)。改良二步酶消化法得到的毛乳頭干凈，真皮鞘殘留少（圖1A）；一步酶消化法得到的毛乳頭形態(tài)大多比較完整（圖1B）；顯微解剖法得到的毛乳頭形態(tài)完整，可見殘留真皮鞘（圖1C）。毛乳頭分離效率比較見表1。

2.毛乳頭細胞培養(yǎng)：改良二步酶消化法分離出的毛乳頭接種24 h后33%貼壁，1周后貼壁率達到96%。貼壁的毛乳頭2 d后即有細胞遷出，剛遷出的細胞多呈三角形或短梭形，細胞質(zhì)豐富，細胞體積較大，隨細胞增殖呈多層聚集生長現(xiàn)象（圖2A）。一步酶消化法和顯微解剖法分離的毛乳頭細胞遷出較改良二步酶消化法慢（圖2B、2C），細胞形態(tài)和其他特性都相同。毛乳頭貼壁和細胞遷出情況比較見表1。對改良二步酶消化法消化過程中產(chǎn)生的懸浮細胞進行培養(yǎng)，未見細胞貼壁或生長。

3.毛乳頭細胞傳代：用上述方法傳代后第2天即可見細胞貼壁展開，傳代后的毛乳頭細胞逐漸重新傾向凝集性生長，隨著時間的增加，凝集生長現(xiàn)象逐漸明顯，但隨著傳代次數(shù)增加，凝集性生長現(xiàn)象逐漸消失，6代以后基本不再出現(xiàn)凝集性生長現(xiàn)象（圖3）。

圖1 3種方法分離得到的腋窩毛乳頭

圖2 3種方法分離得到的毛乳頭細胞遷出情況（×40）

表1 3種方法分離毛乳頭及毛乳頭細胞培養(yǎng)結(jié)果對比

圖3 改良二步酶消化法分離得到的腋窩毛乳頭細胞生長情況

圖4 改良二步酶消化法分離得到的腋窩毛乳頭細胞鑒定（免疫熒光×400）

4.免疫熒光結(jié)果：腋窩毛乳頭細胞層黏連蛋白和Ⅳ型膠原皆呈陽性表達（圖4）。

四、討論

毛乳頭細胞最為顯著的功能是誘導毛囊形成，其功能異常是導致毛囊周期失衡和脫發(fā)的主要起始因素，因此體外分離培養(yǎng)DPC是研究毛囊的前提和基礎(chǔ)。頭皮標本來源有限，不便收集，腋窩與頭皮DPC在結(jié)構(gòu)和功能上相近，是研究毛囊更好的細胞來源。腋窩標本易于收集，因此分離培養(yǎng)腋窩DPC具有重要的意義。

目前DPC的分離方法主要分為顯微解剖法和酶消化法，顯微解剖法需要特殊的體視顯微鏡，普通實驗室難以具備，并且技術(shù)要求高，難以廣泛開展。酶消化法簡便、快速，但標本需求量大，實際工作中難以保證充足的標本來源。腋窩標本組織皮下脂肪厚，毛囊密度稀疏，傳統(tǒng)方法不便分離。我們在已建立的改良二步酶消化法基礎(chǔ)上，改良建立了一種簡單、高效、易操作、適合腋窩DPC分離培養(yǎng)的方法，先粗分離出單個毛囊，分離毛囊后切下毛球部進行消化，盡量去除毛囊單位周圍的脂肪、膠原和結(jié)締組織，有利于消化。膠原酶能夠最大限度地消化毛干和上皮細胞，未消化的易被撿出，在倒置顯微鏡下還能用眼科鑷將被纖維組織等纏繞的毛乳頭釋放出來，減少毛乳頭的損失。此改良方法擁有顯微解剖法標本利用率高、毛乳頭損失少和酶消化法操作簡單、技術(shù)要求低的優(yōu)點，且比一步酶消化法消化效果好，提高了細胞分離純度，減少了雜質(zhì)，是一種較理想的分離培養(yǎng)腋窩DPC的方法，具有推廣應用價值。