劉佩佩 趙森 蔣羅昕 張京 徐維娜 徐建雄

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征致使骨骼脆性增加及骨折危險性增加的一種代謝性疾病，常見于老年人。全國第六次人口普查數(shù)據(jù)顯示，2010年60歲以上人口占全國人口13.26%，這個比例仍在提高[1]，隨著我國老齡化現(xiàn)象日益嚴重，骨質(zhì)疏松癥患者大幅度增加，對家庭、社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。骨密度(Bone mineral density，BMD)是診斷骨質(zhì)疏松和預(yù)測骨質(zhì)疏松骨折的重要手段[2]。鈣、磷是影響骨密度的主要營養(yǎng)因素，其中鈣與骨密度的關(guān)系非常的密切，足量鈣攝入是骨骼健康發(fā)育的基本保證和骨骼正常生長及形成峰值骨量的物質(zhì)基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究證明，鈣對峰值骨量起重要作用[3，4]。在骨組織內(nèi)磷構(gòu)成了骨骼最重要的無機成分，并且參與骨無機基質(zhì)與有機基質(zhì)形成的過程[5]。堿性磷酸酶是一種存在于除了高等植物外幾乎所有生物體內(nèi)的非特異性磷酸單酯酶，其活性是反映骨細胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的重要生化指標[6]。

辣木是一種尚未充分開發(fā)的多功能樹種，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、栽培簡便及抗逆性強等特點。辣木含有豐富的多種礦物質(zhì)、維生素和人體必需氨基酸，其中辣木葉、莖含有的VC是柑桔的6倍，VA是胡蘿卜的4倍，鈣和蛋白質(zhì)含量分別是牛奶的4倍和2倍[7]。據(jù)測定，新鮮辣木葉中鈣、磷含量分別為440mg/100g、70mg/100g[8]，干葉中鈣、磷含量更是高達2000.3mg/100g、228mg/100g[9]。研究證明，在飼料中添加辣木葉粉對提高肉雞脛骨完整性與脛骨骨無機成分有顯著效果[8]。辣木經(jīng)益生菌發(fā)酵后更能提高養(yǎng)分的利用率，辣木發(fā)酵物能否改善大鼠骨骼代謝，促進大鼠骨密度還未見相關(guān)的報道。本試驗以辣木發(fā)酵物飼喂大鼠，觀察其對大鼠生長、腰椎骨密度和鈣磷代謝的影響，旨在為促進骨骼生長，改善骨骼強度的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組和飼養(yǎng)管理

24只4周齡健康清潔級雄性SD大鼠(體重74.38±0.63 g,購于上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2013-0006),按體重隨機分為兩組，兩組初始體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),每組3個重復(fù)，每個重復(fù)4只，分籠飼養(yǎng)。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%辣木發(fā)酵物，顆粒飼料，試驗期10周。

試驗方案通過上海交通大學(xué)動物管理委員會頒布的實驗動物使用和管理指南。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～25 ℃，相對濕度 50%～60%，光照明暗各 12 h，自由飲水與采食。

辣木發(fā)酵物由上海普緹康生物科技有限公司提供。辣木發(fā)酵物由辣木粉碎后經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵液(上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司生產(chǎn)，主要成分為乳酸桿菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌等)厭氧發(fā)酵而成。

1.2 樣品采集與測定

1.2.1體重與采食量：記錄實驗開始與結(jié)束時大鼠的體重、實驗周期中各組大鼠的采食量。

1.2.2血樣的采集與測定：試驗第10周，禁食24 h，按0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉后心臟取血，3 000 r/min離心15 min，取血清分裝于eppendorf管中，-80 ℃冷凍保存待測。

血清中鈣、磷含量分別采用鈣測定試劑盒(比色法)和磷測定試劑盒(磷鉬酸法)測定，堿性磷酸酶活性采用堿性磷酸酶測定試劑盒(微板法)測定。以上試劑盒均由南京建成生物研究所生產(chǎn)，操作嚴格按相應(yīng)試劑盒說明書進行。

1.2.3骨骼的采集與測定：(1)股骨長度和重量：采血后大鼠處死，分離左側(cè)后肢股骨，剔除表面肌肉與結(jié)締組織后，以游標卡尺測量股骨長度，稱取股骨重(濕重)后，105 ℃烘干，稱重(干重)。

(2)腰椎骨密度：剝離并取下第2-第5腰椎骨(L2～L5)，剔干凈骨周邊肌肉，將紗布用生理鹽水沾濕，包裹住骨樣品，外面再包裹一層錫箔紙，防止水分蒸發(fā)，存放在-20 ℃冰箱備用，用于測定骨密度。從-20 ℃冰箱中取出腰椎骨(L2～L5)，室溫自然解凍，用Hologic Discovery A密度儀測定骨密度(BMD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 17.0軟件進行分析。組間差異顯著性采用t檢驗，以P<0.05為顯著性差異標準，以P<0.01為極顯著性差異標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠生長性能

試驗初期兩組大鼠體重上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，試驗期內(nèi)實驗組與對照組平均采食量無顯著變化(P>0.05)，試驗結(jié)束后實驗組大鼠體重顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 不同處理大鼠的體重和采食量(n=12)Table 1 The body weight and food intake of rats with different treatment (n=12)

注：與對照組比較，*P

Compared with control group, *P<0.05;**P<0.01.

2.2 大鼠股骨生長和腰椎骨密度

與對照組相比，實驗組大鼠股骨濕重提高了10%(P<0.05)，股骨干重提高了9.3%(P=0.05388),股骨長度增長了3.3%(P<0.01)。實驗組大鼠的L2～L5腰椎骨密度較對照組提高了8.03%(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 不同處理大鼠股骨生長和腰椎骨密度(n=12)Table 2 The growth of the femurs and the lumbar BMD of rats with different treatments (n=12)

注：與對照組比較，*P

Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01

3.3 血清Ca和P含量、血清堿性磷酸酶活性

與對照組相比，實驗組大鼠血清中Ca含量降低了18.4%，差異極顯著(P<0.01)，血清P含量顯著提高(P<0.05)。實驗組與對照組血清中堿性磷酸酶活性并無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 辣木發(fā)酵物對大鼠血中鈣、磷含量與堿性磷酸酶活性的影響(n=12)Table 3 The effect of fermented moringa on Ca content, P content, and alkaline phosphatase activity in rat (n=12)

注：與對照組比較，*P

Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01

4 討論

骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴重威脅中老年人健康的疾病之一。隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的加重，骨質(zhì)疏松癥將對家庭與社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此對骨質(zhì)疏松癥預(yù)防與治療的研究顯得十分重要。

辣木含有豐富的淀粉，蛋白質(zhì)，維生素A、B、C 以及礦質(zhì)元素，營養(yǎng)素全面，且適口性好。有實驗證明，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步外消化法測定多種熱帶或灌木的葉片蛋白質(zhì)的表觀消化率，發(fā)現(xiàn)辣木蛋白質(zhì)體外消化率最高，達79.2%[10]；在肉雞日糧中添加辣木葉粉，能改善仔雞免疫功能，對肉雞的增重和降低料肉比有顯著作用[11];Mohammed等[12]報道，用辣木鮮葉飼喂蛋雞發(fā)現(xiàn)能在一定程度上提高產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗中在基礎(chǔ)日糧中添加辣木發(fā)酵物對大鼠的采食量沒有明顯的作用，但大鼠增重有顯著提高，可能是辣木發(fā)酵物有提高大鼠的飼料轉(zhuǎn)化率、降低料肉比的功效，從而促進了大鼠的生長。

辣木發(fā)酵物可促進大鼠骨骼發(fā)育和骨骼強度。辣木具有高鈣高磷的特點，同時含有多種維生素，對骨骼骨質(zhì)增加、沉淀鈣磷有積極作用。另有報道，辣木葉中總黃酮含量高達46.17 mg/g[13]，黃酮類物質(zhì)能夠通過不同轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進成骨細胞生成、抑制破骨細胞分化，有提高骨密度與骨礦含量的作用[14]。有實驗證明，用灌胃法給SD大鼠飼喂添加不同濃度辣木葉粉的飼料，對大鼠血清堿性磷酸酶活性并無顯著影響[15]，這與本實驗結(jié)果一致。本實驗發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠血清磷含量提高，而血清鈣水平降低。磷作為動物體生長重要的礦物元素，有著形成和維持骨骼組織、影響血鈣的吸收沉積等作用，而辣木含有豐富的鈣(辣木干葉中鈣、磷含量分別為2000.3 mg/100 g、228 mg/100 g)，且辣木鈣磷易吸收。Thobela Nkukwana[8]發(fā)現(xiàn)飼料中添加辣木葉粉對提高肉雞脛骨完整性與脛骨骨無機成分有顯著效果，本實驗飼喂辣木發(fā)酵物后大鼠血清鈣降低可能是由于血鈣大量沉積于骨骼所致，實驗組大鼠股骨重量、長度和腰椎骨密度顯著提高的結(jié)果也印證了該推測。

綜上所述，生長期大鼠日糧中添加辣木發(fā)酵物可顯著促進大鼠生長發(fā)育，促進大鼠骨骼中鈣的沉積和骨骼生長，提高骨骼強度。