齊雪松，王春燕，李 辰 ，佟 鵬，邵 帥，曲功霖，茍 巧 ，蘇 旭*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國(guó)疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

細(xì)胞微絲對(duì)細(xì)胞生物學(xué)各個(gè)方面都有影響，參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞分化等一系列重要功能[1]。絲切蛋白(cofilin)可促進(jìn)微絲解離，抑制單體肌動(dòng)蛋白聚合，最終引起微絲骨架改變[2]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在3種絲切蛋白家族成員，即肌動(dòng)蛋白聚合因子(actin depolymerizing factor，ADF)、cofilin 1和cofilin 2。其中ADF和cofilin 1主要存在于非肌肉細(xì)胞中，cofilin 2主要存在于肌肉細(xì)胞中，cofilin 1比ADF在肌動(dòng)蛋白成核過(guò)程和剪切過(guò)程起著更重要的作用[3]。cofilin 1蛋白廣泛存在于靜息細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞活化，它會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)的邊緣，參與微絲骨架的高速組裝和細(xì)胞移動(dòng)[4]。cofilin 1在機(jī)體組織中的表達(dá)水平不盡相同，在神經(jīng)系統(tǒng)、腸道、腎臟和睪丸中表達(dá)較高，在造血組織、破骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中也有較高表達(dá)[5-6]。有研究報(bào)道，cofilin 1在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞骨架重排，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。下調(diào)LIMK1-ADF/cofilin可抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。當(dāng)γ射線誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)微絲隨照射劑量增大而損傷加重，cofilin基因表達(dá)隨照射劑量的增大而上調(diào)[9]。這些結(jié)果表明cofilin的表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞的功能狀態(tài)發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要參與者，同時(shí)具有較高輻射敏感性，大劑量電離輻射時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞的急性損傷嚴(yán)重，是醫(yī)療救治的難點(diǎn)。因此，本項(xiàng)目擬通過(guò)觀察γ射線誘導(dǎo)BALB/c小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的微絲形態(tài)變化和對(duì)cofilin蛋白磷酸化的影響，探討cofilin及相關(guān)蛋白在輻射損傷中的作用，為臨床救治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及探索新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)BALB/c小鼠，60只，雄性，4～6周齡(北京維通利華)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2011-0039。SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水，觀察無(wú)異常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將36只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組(0 h組)、照后3、6、9、12和24 h組，除對(duì)照組外，其他組給予2 Gy γ射線照射，于照后各時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出胸腺，用吸滿0.01 mol/L PBS溶液的1 mL注射器(美國(guó)BD公司)將胸腺中的淋巴細(xì)胞沖出，離心收集細(xì)胞。通過(guò)cofilin基因mRNA和蛋白的表達(dá)檢測(cè)，確定適宜的取材時(shí)間。再將另24只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為未照射(0 Gy)組、2、6和10 Gy組，除未照射組外，其他組給予不同劑量的γ射線照射，于前述確定的適宜時(shí)間取材，進(jìn)行cofilin蛋白、磷酸化cofilin蛋白(phosphorylated cofilin，p-cofilin)、LIM激酶1 (LIM domain kinase 1，LIMK1)、TES激酶2(testicular protein kinase 2，TESK2)和Slingshot家族的磷酸酶2 (slingshot phosephatase 2，SSH2)蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2 照射條件

分別將小鼠裝進(jìn)照射盒內(nèi)，劑量率為0.3 Gy/min，60Co γ射 線 (新 華 FCC-7000A)全 身 一 次 均 勻 照 射 ， 2 Gy照射時(shí)間約為400 s，6 Gy照射時(shí)間約為1 200 s，10 Gy照射時(shí)間約為2 000 s。

1.3 熒光雙標(biāo)法觀察微絲形態(tài)

用4%多聚甲醛(美國(guó)Sigma Aldrich公司)固定收集的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞，加入300 μL 0.2% Triton-X 100，室溫靜置5 min，離心棄上清。加入200 μL 0.5% BSA，室溫靜置10 min，離心棄上清。加入FITC-鬼筆環(huán)肽(Phalloidin，美國(guó)Sigma Aldrich公司，針對(duì)actin微絲蛋白)和Alex Fluor 594連接的脫氧核糖核酸酶I (美國(guó)Invitrogen公司)，終濃度均為5 μg/mL，混勻、孵育，離心棄上清。用0.01 mol/L PBS 1 mL清洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度約為104～ 105/mL?；靹?，取10 μL細(xì)胞懸液滴片，并用含有DAPI的抗熒光淬滅劑(美國(guó)Vector公司)封片。激光共聚焦顯微鏡觀察胸腺細(xì)胞微絲的形態(tài)變化。

1.4 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)檢測(cè)cofilin mRNA的表達(dá)水平

Trizol法提取小鼠胸腺淋巴細(xì)胞總RNA，取1 μL總RNA原液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)NANODROP 2000(美國(guó)Thermo Fisher公司)直接檢測(cè)，讀取D(260)/D(280)比值和濃度值，各組總RNA D(260)/D(280)值在1.78～2.02范圍內(nèi)，符合實(shí)驗(yàn)要求。以各組總RNA為模板，按GoScript反轉(zhuǎn)錄體系(美國(guó)Promega公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成。以GAPDH為內(nèi)參基因，cofilin為目的基因，SYBR染料法(美國(guó)Invitrogen公司)檢測(cè)小鼠胸腺細(xì)胞中cofilin mRNA表達(dá)水平。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取經(jīng)BCA法定量的蛋白樣品25 μg，與5×蛋白上樣緩沖液(上海生工)混勻，置于沸水中加熱5 min，使蛋白質(zhì)變性。迅速放入冰中冷卻，離心后SDSPAGE電 泳 ， PVDF膜 (美 國(guó) Millipore公 司 )轉(zhuǎn) 膜 ， 5%

B

SA封 閉 (上 海 生 工 )， 分 別 用 cofilin、 p-cofilin、LIMK1、TEST2、SSH2和GAPDH一抗孵育，4 ℃過(guò)夜，二抗孵育，室溫1 h(抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司)，滴加發(fā)光液(美國(guó)Santa Cruze公司)，用ChemiDoc XRC+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)拍攝條帶圖像。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用2-ΔΔCT法對(duì)qPCR結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析，用成像分析系統(tǒng)測(cè)量Western blot條帶的灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白進(jìn)行灰度值對(duì)比校正，得到蛋白的相對(duì)表達(dá)量。用SAS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 γ射線誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞不同時(shí)間cofilin基因表達(dá)的變化

由于2-ΔΔCT法要求目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率一致，因此根據(jù)cDNA濃度梯度的log值(X)和ΔCT值 (Y)，求出兩者的線性關(guān)系，Y=8.2+0.092X，斜率為0.092，接近于0，說(shuō)明cofilin基因與GAPDH基因擴(kuò)增效率一致，可用2-ΔΔCT法對(duì)cofilin基因mRNA表達(dá)的進(jìn)行相對(duì)定量分析。

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)方差齊(F=2.40、1.67、0.12，P＞0.05)，可用于方差分析。圖1A可見(jiàn)，與對(duì)照組(0 h組)比較，cofilin基因mRNA表達(dá)在照后24 h內(nèi)，除12 h組外，其余各時(shí)間組均呈明顯的下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05)。cofilin蛋白表達(dá)在照后3和9 h組呈明顯降低(t=2.58、3.04，P＜0.05)，其他組變化并不明顯，見(jiàn)圖1C。p-cofilin蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與cofilin蛋白相似，但與0 h組比較各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？紤]cofilin基因表達(dá)在照后3 h明顯下調(diào)，且為最早出現(xiàn)變化的時(shí)間點(diǎn)，因此選擇照后3 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)取材時(shí)間。

圖1 2 Gy γ射線誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞24 h內(nèi)的cofilin基因表達(dá)和p-cofilin蛋白表達(dá)變化

2.2 不同劑量γ射線誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞微絲形態(tài)的變化

激光共聚焦顯微鏡下觀察，未照射的胸腺淋巴細(xì)胞質(zhì)纖維形肌動(dòng)蛋白(fibrous actin，F(xiàn)-actin，綠色標(biāo)記)清晰可見(jiàn)、排列緊密、形態(tài)完整、邊緣光滑、顏色明亮、球形肌動(dòng)蛋白 (globular actin，G-actin，紅色標(biāo)記)彌散且均勻分布于胞質(zhì)中，細(xì)胞核(藍(lán)色標(biāo)記)顏色較淡。2、6和10 Gy γ射線誘導(dǎo)后3 h，細(xì)胞的F-actin含量隨照射劑量增大而逐漸減少，細(xì)胞核明顯，有的細(xì)胞中可見(jiàn)F-actin疏松的絲狀排列或斷裂的F-actin小體。G-actin分布不均勻，呈團(tuán)塊狀聚集(圖2)。

2.3 不同劑量γ射線誘導(dǎo)BALB/c小鼠胸腺淋巴細(xì)胞cofilin和p-cofilin蛋白表達(dá)的變化

2、6和10 Gy γ射線誘導(dǎo)3 h后取材，與0 Gy組比較，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加，各照射組cofilin蛋白表達(dá)量逐漸上調(diào)，其中10 Gy組上調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而p-cofilin的表達(dá)隨射線劑量的增加而下調(diào)，其中10 Gy組下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。這表明，隨著照射劑量的增加，p-cofilin蛋白表達(dá)量減少，cofilin蛋白表達(dá)量增高，引起F-actin快速解聚，抑制G-actin的聚合，淋巴細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。

圖2 不同劑量γ射線誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞微絲形態(tài)的變化

2.4 不同劑量γ射線對(duì)cofilin磷酸化酶和去磷酸化酶表達(dá)的影響

如圖4所示，磷酸化酶LIMK1蛋白和TESK2蛋白表達(dá)隨γ射線劑量增大而小幅下調(diào)。去磷酸酶SSH2蛋白的表達(dá)隨γ射線劑量增大而增高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖4 不同劑量γ射線誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞cofilin磷酸化酶和去磷酸化酶蛋白表達(dá)的變化

3 討論

cofilin蛋白的活性主要由其Ser3位點(diǎn)磷酸化與否進(jìn)行調(diào)控，LIMK和TESK為主要的磷酸化酶，使Ser3位點(diǎn)磷酸化，cofilin蛋白失活，不能與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合，提高了F-actin的穩(wěn)定性；SSH為主要的去磷酸化酶，使Ser3位點(diǎn)去磷酸化，激活cofilin蛋白，使其能夠與F-actin結(jié)合，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚[10]。由此可見(jiàn)，cofilin的磷酸化進(jìn)程是肌動(dòng)蛋白解聚的開(kāi)關(guān)。cofilin可結(jié)合G-actin，參與去組裝過(guò)程，是去組裝過(guò)程中不可或缺的蛋白，但磷酸化的cofilin與G-actin的親和性顯著降低[11]。對(duì)人結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)程的研究發(fā)現(xiàn)，LIMK/cofilin通路上的LIMK1、LIMK2和SSH2的過(guò)表達(dá)與結(jié)腸癌的進(jìn)程及其化學(xué)抗藥性相關(guān)，并有望成為結(jié)腸癌治療中的腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[12]。在腦型瘧疾研究中發(fā)現(xiàn)，LIMK1/cofilin1通路的失調(diào)，使得神經(jīng)細(xì)胞的樹(shù)突形態(tài)發(fā)生改變，形成了actin-cofilin小體[13]。這些研究顯示了LIMK/cofilin通路在疾病研究中的重要性，但在電離輻射誘導(dǎo)的損傷機(jī)制研究中相關(guān)的報(bào)道并不多見(jiàn)。

本研究檢測(cè)了γ射線誘導(dǎo)BALB/c小鼠胸腺淋巴細(xì)胞cofilin 1、p-cofilin、LIMK1、TESK2和SSH2蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加，cofilin 1的表達(dá)有增加的趨勢(shì)，而p-cofilin的表達(dá)則減少，磷酸化酶LIMK1和TESK2的表達(dá)小幅下調(diào)，但去磷酸化酶SSH2的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，因此可推測(cè)，隨著照射劑量的增加，更多的SSH2使p-cofilin的Ser3位點(diǎn)去磷酸化，這使得細(xì)胞質(zhì)中cofilin 1的含量增多，參與到微絲骨架組裝的過(guò)程中，并能使淋巴細(xì)胞進(jìn)入活躍狀態(tài)，其遷移能力增強(qiáng)，行使各項(xiàng)功能，以增強(qiáng)對(duì)射線的抵抗能力。但2 Gy γ射線誘導(dǎo)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，cofilin 1 和p-cofilin的含量均減少，這可能是細(xì)胞內(nèi)貯存的pcofilin受損或消耗過(guò)多，cofilin 1供應(yīng)不足，淋巴細(xì)胞的活化能力降低，輻射敏感性增強(qiáng)。當(dāng)上調(diào)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的cofilin蛋白表達(dá)，U251的輻射抗性顯著增強(qiáng)，下調(diào)cofilin蛋白表達(dá)后，U251的遷移能力和輻射抗性均降低[14]。肝癌細(xì)胞也有類似的表現(xiàn)，當(dāng)pcofilin表達(dá)的增多可以使肝癌細(xì)胞的遷移能力降低[15]。Jurkat T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)SSH基因沉默會(huì)降低細(xì)胞的遷移和活化[16]。

放射治療中的免疫細(xì)胞降低一直是影響療效的首要副作用[17]，其產(chǎn)生的機(jī)制并未探明。雖然已有一些防治措施，但療效未達(dá)預(yù)期。從微絲的角度探討免疫細(xì)胞輻射敏感的機(jī)制研究正逐漸成為熱點(diǎn)，并具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)電離輻射誘導(dǎo)微絲改變的機(jī)制進(jìn)行了初步摸索，發(fā)現(xiàn)了一些變化規(guī)律，提出假設(shè)，進(jìn)一步驗(yàn)證工作亟待深入。