林 琳，范瀟予，李恩燦，凌亞豪，臧清策，林 生，賀玖明，靳洪濤，3，*

（1．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050；2．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；3．北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，北京 100176）

近幾十年來(lái)，臨床上關(guān)于中藥注射液(traditional Chinese medicine injections，TCMIs)不良反應(yīng)報(bào)道日益增加[1]，其中，發(fā)生率最高的是免疫介導(dǎo)的藥物不良反應(yīng)，如急性過敏反應(yīng)、過敏性休克[2]。 既往研究[3]發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)及其二聚體[5，5’-oxydimethylenebis(2-furfural)，OMBF]可能與含糖中藥注射液引發(fā)的免疫刺激(如超敏反應(yīng)和自身免疫反應(yīng))有一定的相關(guān)性。已有研究[4-6]表明生脈、脈絡(luò)寧和丹香冠心3種注射劑在臨床中均能夠引起包括過敏反應(yīng)在內(nèi)的不良反應(yīng)。我們?cè)谇捌谑惺壑兴幾⑸湟?-HMF及其二聚體的篩查中發(fā)現(xiàn)生脈、脈絡(luò)寧和丹香冠心注射劑均含有較高含量的5-HMF及OMBF[7-8]。因此，探究此3種注射液潛在的免疫毒性以及5-HMF單體和二聚體可能發(fā)揮的作用十分必要。由于5-HMF及其二聚體均為小分子化合物，傳統(tǒng)致敏試驗(yàn)動(dòng)物模型可能存在假陰性結(jié)果，因此本研究選擇小鼠直接腘窩淋巴結(jié)(direct popliteal lymph node assay，D-PLNA)和報(bào)告抗原腘窩淋巴結(jié)(reporter antigen popliteal lymph node assay，RA-PLNA)模型對(duì)上述3種注射液進(jìn)行了免疫毒性評(píng)價(jià)，進(jìn)而初步探究免疫毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，共128只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，保持12 h晝夜節(jié)律，動(dòng)物自由進(jìn)食水，試驗(yàn)過程中動(dòng)物使用和相關(guān)處置符合動(dòng)物福利倫理要求。

1.2 供試品與試劑

丹香冠心注射液(批號(hào)51150106)、脈絡(luò)寧注射液(批號(hào)20140928)、生脈注射液(批號(hào)13120711)，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所分析代謝中心賀玖明老師提供。陽(yáng)性對(duì)照藥物苯妥英鈉(批號(hào)57-41-0)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。報(bào)告抗原TNP-Ficoll(批號(hào)044807)和TNP-OVA(批號(hào)047104)，規(guī)格均為每瓶10 mg，均購(gòu)自美國(guó)BioSearch公司。小鼠IgE預(yù)包被ELISA試劑盒(批號(hào)E2820-1607-1)和小鼠MCP-1預(yù)包被ELISA試劑盒(批號(hào)E2739-1601-1)，均購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組設(shè)計(jì) 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為16組，其中D-PLNA模型為5組，即生理鹽水對(duì)照組，脈絡(luò)寧、生脈、丹香冠心注射液各1組，陽(yáng)性藥物苯妥英鈉對(duì)照組；RA-PLNA模型為11組，即上述5組分別聯(lián)合報(bào)告抗原三硝基苯基聚蔗糖(2，4，6-trinitrophenyl-Ficoll，TNP-Ficoll)和三硝基苯基卵蛋白(TNP-ovalbumin，TNP-OVA)作用組，另設(shè)生理鹽水對(duì)照組，每組8只。報(bào)告抗原的劑量為每只10 μg，給藥體積均為50 μL，陽(yáng)性藥物給藥劑量為每只2 mg。上述3種中藥注射液中5-HMF和OMBF的給藥濃度和劑量見表1。1.3.2 給藥及樣本收集 D-PLNA模型中，BALB/c小鼠后足趾部70%酒精消毒，用1 mL注射器針頭于左側(cè)足趾部皮下注射3種中藥注射液及陰、陽(yáng)性受試物，右側(cè)為對(duì)照側(cè)。給藥后第7天，取出淋巴結(jié)，備用。RA-PLNA模型中，將3種中藥注射液、陽(yáng)性藥物和生理鹽水分別與10g TNP-OVA或TNP-Ficoll粉末混合后，注射于小鼠足趾部，給藥方式相同，取出淋巴結(jié)后備用。將各組淋巴結(jié)置于200目不銹鋼篩網(wǎng)上，用玻璃研磨器輕輕研碎，同時(shí)以1% FBS-1640沖洗淋巴細(xì)胞液于培養(yǎng)皿中，吹勻并收集細(xì)胞懸液，4 ℃ 、1 5 00 r/min離心后，重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按下面公式計(jì)算細(xì)胞指數(shù)(cellularity index，CI)。

表1 3種中藥注射液中5-HMF和OMBF給藥濃度及劑量

CI=處理側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)/未處理側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)

1.3.3 ELISA法測(cè)定免疫相關(guān)因子濃度 將淋巴結(jié)細(xì)胞懸液培養(yǎng)于96孔板，加入刺激劑脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，濃度為4 μg/mL，均為每孔100 μL，培養(yǎng)箱孵育16～18 h，收集細(xì)胞上清液。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定上清液中免疫球蛋白IgE、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)及分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果均以-x±s 表示，進(jìn)行單因素方差分析，組間差異比較采用LSD法。此外，CI≥2且與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，認(rèn)為模型的細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)呈陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞濃度

在D-PLNA模型中(表2)，注射液丹香冠心和苯妥英鈉陽(yáng)性對(duì)照組的處理側(cè)與對(duì)照側(cè)以及生理鹽水對(duì)照組比較，淋巴結(jié)細(xì)胞濃度均顯著升高，CI 也顯著升高(P＜0.05)，但丹香冠心組CI小于2，提示丹香冠心組DPLNA反應(yīng)為陰性。加入報(bào)告抗原TNP-OVA后，與對(duì)照側(cè)相比，各中藥注射液組細(xì)胞濃度有上升的趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；加入報(bào)告抗原TNPFicoll后，與對(duì)照側(cè)相比，脈絡(luò)寧、生脈、丹香冠心注射液以及陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞濃度均顯著升高(P＜0.05)，脈絡(luò)寧、丹香冠心注射液較生理鹽水對(duì)照組亦顯著升高(P＜0.05)，且各組CI 均大于2(表3)，提示RA-PLNA反應(yīng)為陽(yáng)性。

表2 D-PLNA模型中3種中藥注射液對(duì)淋巴結(jié)細(xì)胞濃度的影響(-x±s，n=8)

2.2 相關(guān)免疫因子的濃度變化

2.2.1 中藥注射液對(duì)IgE的影響 免疫球蛋白IgE是介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。在D-PLNA模型中，3種中藥注射液對(duì)IgE無(wú)促進(jìn)作用(表4)。與對(duì)照側(cè)相比，加入TNP-OVA后，脈絡(luò)寧、丹香冠心注射液與陽(yáng)性藥物對(duì)照組IgE水平顯著升高(P＜0.05)，加入TNPFicoll后，脈絡(luò)寧注射液和陽(yáng)性藥物對(duì)照組均促進(jìn)IgE的分泌，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。

表3 RA-PLNA模型中3種中藥注射液對(duì)淋巴結(jié)細(xì)胞濃度的影響(-x±s，n=8)

表4 D-PLNA模型中，3種中藥注射液對(duì)IgE和MCP-1濃度的影響(-x±s，n=8)

表5 RA-PLNA模型中，3種中藥注射液對(duì)IgE和MCP-1濃度的影響(-x±s，n=8)

2.2.2 中藥注射液對(duì)MCP-1的影響 結(jié)果顯示，在D-PLNA模型中，與對(duì)照側(cè)相比，各組均無(wú)顯著差異(表4)。加入報(bào)告抗原后，丹香冠心注射液與報(bào)告抗原TNP-OVA共同作用時(shí)，與生理鹽水陰性對(duì)照組相比顯著促進(jìn)MCP-1的分泌(P＜0.05)，而與TNP-Ficoll聯(lián)合給藥后，與未處理側(cè)相比，MCP-1濃度顯著升高(P＜0.05)；而脈絡(luò)寧與生脈注射液與TNP-Ficoll作用時(shí)，和生理鹽水組相比，MCP-1濃度均顯著升高(P＜0.05)，見表5。

3 討論

在直接腘窩淋巴結(jié)實(shí)驗(yàn)(D-PLNA)中，只有丹香冠心注射液細(xì)胞濃度顯著增加。由于中藥注射液成分復(fù)雜，5-HMF單體和二聚體為小分子化合物，需要與蛋白結(jié)合后才能誘發(fā)免疫失調(diào)，所以我們需要利用RAPLNA模型進(jìn)一步觀察其對(duì)淋巴細(xì)胞的影響，對(duì)中藥注射液的致敏性進(jìn)行更完整深入的評(píng)價(jià)，以充分提示臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)[9]。

在報(bào)告抗原腘窩淋巴結(jié)實(shí)驗(yàn)(RA-PLNA)中，本實(shí)驗(yàn)選取TNP-OVA和TNP-Ficoll兩種報(bào)告抗原。TNPOVA是一種T細(xì)胞依賴性抗原，當(dāng)給予極低劑量時(shí)，自身不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)，需要輔助性共刺激信號(hào)存在時(shí)才能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體。而TNP-Ficoll是一種非T細(xì)胞依賴性抗原，只有存在新的抗原表位并被T細(xì)胞識(shí)別后，才能產(chǎn)生IgE抗體，并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[10-11]。MCP-1是促炎細(xì)胞因子，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞分泌，可以激活巨噬細(xì)胞，刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脈絡(luò)寧注射液加入0.2 μg/μL TNP-OVA后，IgE分泌顯著增加，而加入0.2 μg/μL TNP-Ficoll后，細(xì)胞濃度及MCP-1濃度與對(duì)照側(cè)相比顯著升高，提示脈絡(luò)寧注射液中可能存在小分子物質(zhì)，可以作為一種新的抗原與報(bào)告抗原結(jié)合后被T細(xì)胞識(shí)別誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。生脈注射液僅與0.2 μg/μL TNP-Ficoll共同作用時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)呈陽(yáng)性，且MCP-1濃度較對(duì)照側(cè)顯著升高，提示我們生脈注射液中也可能存在作為新的抗原分子的物質(zhì)。丹香冠心注射液與0.2 μg/μL TNP-OVA共同作用時(shí)，顯著促進(jìn)IgE和MCP-1的分泌，而加入相同劑量TNP-Ficoll后，細(xì)胞濃度和MCP-1濃度與對(duì)照側(cè)相比顯著升高，同時(shí)在D-PLNA中，細(xì)胞數(shù)顯著增加，提示丹香冠心注射液成分復(fù)雜，可能直接誘導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)，也可能作為半抗原的小分子物質(zhì)與報(bào)告抗原結(jié)合誘發(fā)超敏反應(yīng)。

總之，在D-PLNA模型中反應(yīng)為陰性的指標(biāo)，在注射劑與報(bào)告抗原共同作用后，出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，由于D-PLNA容易出現(xiàn)假陰性，對(duì)于半抗原引起的免疫失調(diào)不敏感的特點(diǎn)，我們可以得出結(jié)論，RA-PLNA對(duì)于5-HMF單體和二聚體的致敏性更為敏感，而通過加入不同的報(bào)告抗原能夠進(jìn)一步確證受試物在體內(nèi)僅僅是炎癥刺激物還是形成了新的抗原或表位[13]，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供思路和方向。但由于中藥注射液成分復(fù)雜，可能同時(shí)存在包括5-HMF單體以及二聚體等多種小分子物質(zhì)，對(duì)其單獨(dú)成分的進(jìn)一步免疫評(píng)價(jià)也十分必要。

與此同時(shí)，中國(guó)藥典對(duì)中藥注射液中5-HMF及其二聚體的含量限度并沒有明確的規(guī)定，我們先前的研究證明5-HMF可以作為一種輔助刺激因子誘導(dǎo)Ⅰ型免疫反應(yīng)，OMBF可提供輔助刺激信號(hào)和作為新的抗原表位被識(shí)別，從而誘導(dǎo)Ⅰ型和Ⅱ型混合型免疫反應(yīng)，也能促進(jìn)非同源的T、B細(xì)胞間相互作用[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了5-HMF及其二聚體OMBF可能在中藥注射液中作為小分子半抗原與體內(nèi)蛋白相結(jié)合造成免疫系統(tǒng)的失調(diào)。因此，為了進(jìn)一步提高用藥安全，對(duì)相關(guān)中藥注射液中小分子物質(zhì)5-HMF單體及二聚體的質(zhì)量控制和深入研究非常必要。