蔣正財(cái)，陳統(tǒng)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，2015年我國(guó)CRC患病人數(shù)男性新增21.57萬(wàn)，女性新增16.06萬(wàn)，死亡人數(shù)男性為11.11萬(wàn)，女性為8萬(wàn)[1]。近年來，抗血管治療無論在基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用中都取得了一定的成果，如貝伐單抗是美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的一線治療CRC的重組人源化單克隆抗體，但靶向腫瘤血管藥物卻存在價(jià)格昂貴、容易出現(xiàn)不良反應(yīng)及耐藥等缺點(diǎn)，而我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥治療腫瘤具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，以及價(jià)格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，可彌補(bǔ)此方面的缺陷。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枸杞多糖(LBP)可抑制肝癌模型小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)皮子(VEGF)的表達(dá)[2]，LBP是否具有抑制CRC腫瘤血管形成的作用，其具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 6～8周SPF級(jí)SD大鼠2只，雌性，體質(zhì)量(200±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041。6～8周SPF級(jí)Balb/c小鼠16只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫20～26℃、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中，晝夜明暗光照時(shí)間(12 h明/12 h暗)。小鼠CRC結(jié)直腸癌細(xì)胞株(CT26)細(xì)胞和人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 藥物、試劑與儀器 LBP(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，生產(chǎn)批號(hào)：K140828)購(gòu)于中國(guó)西安開來生物工程有限公司，CD31抗體購(gòu)于Abcam公司，免疫組化抗兔二抗購(gòu)于中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)公司；PCR引物由中國(guó)英濰捷基公司合成，DAB購(gòu)于美國(guó)CST公司；matrigel購(gòu)于美國(guó)BD公司，SYBR Green Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Takara公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；白光拍攝顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 建立小鼠結(jié)直腸癌模型 把小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CT26細(xì)胞按照每只小鼠2×105個(gè)/0.2 mL接種于小鼠左側(cè)腋前皮下。4天后可看到腫瘤長(zhǎng)出，開始給藥，依據(jù)課題組前期研究基礎(chǔ)[3～4]，LBP給藥濃度為50 mg/kg，腹腔注射，每2天給藥1次；游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑，每2天檢測(cè)1次，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，共給藥12天。在給藥結(jié)束后，脫臼處死小鼠，腫瘤剝離后稱重，放入體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋、病理制片。

1.4 免疫組化染色 常規(guī)脫蠟-切片腫瘤組織，PBS洗3次，每次5 min，檸檬酸鈉修復(fù)液(pH 6.0)高溫高壓熱修復(fù)8 min，自然冷卻后放入3%H2O2甲醇溶液37℃浸泡30min，PBS再洗3次，每次5 min，組織上加10%BSA封閉，加一抗CD31置于4℃過夜。將組織切片從封閉盒中拿出，PBS洗3次，每次5 min，于組織上加上二抗辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗37℃孵育1 h，然后PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色10 s，流水沖掉，蘇木素復(fù)染30 s流水沖洗，接著常規(guī)脫水，最后于組織上滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片，自然晾干。

1.5 大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn) 6～8周齡SD雌性大鼠，用乙醚麻醉后脫臼處死；將大鼠浸泡于75%酒精中2 min，放入原代細(xì)胞房操作臺(tái)中，打開胸腔，沿脊柱剪下大鼠胸主動(dòng)脈；將血管置于大的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入無菌PBS洗3遍，除去血液；用精密剪、精密鑷剝離干凈血管周圍結(jié)締組織，用精密剪將血管剪成1 mm高圓環(huán)；在細(xì)胞傳代房間超凈臺(tái)中，提前于4℃預(yù)冷槍頭、48孔板，在冰上把matrigel 100 μL加入48孔板中，避免氣泡，輕輕拍打48孔板使其分布均勻，把48孔板放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中15 min使matrigel凝固；用精密鑷將剪好的血管環(huán)放入凝固的matrigel中，使其位于中央，再加入matrigel 100 μL，避免氣泡，將48孔板放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中15 min使matrigel凝固。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，LBP藥物濃度為500 μg/mL及1000 μg/mL兩個(gè)濃度，用EBM培養(yǎng)基配制，500 μL/孔，每天觀察血管生長(zhǎng)情況，8天后，向48孔板中加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30 min后拍照。

1.6 CCK 8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將CT26和HDMEC對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以2000個(gè)/孔接種于96孔板中，第2天棄掉培養(yǎng)基，LBP藥物濃度設(shè)計(jì)為0、50、100、200、500、1000 μg/mL，用培養(yǎng)基稀釋后，每孔100 μL加入，48 h后，每孔加入10 μL CCK8，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h后，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)量每孔吸光度。

1.7 QPCR檢測(cè)HDMEC細(xì)胞腦組織特異性血管生成抑制因子1（B AI1）基因的表達(dá) 培養(yǎng)HDMEC細(xì)胞，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞匯合度達(dá)到90%，消化，計(jì)數(shù)，按1.0×105個(gè)/孔鋪6孔板。第2天，棄掉培養(yǎng)基，用EBM培養(yǎng)基配置500 μg/mL和1000 μg/mL的枸杞多糖用藥組，對(duì)照組加入相同體積的EBM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。48 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，棄掉PBS；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA用DEPC稀釋8倍后，按照試劑盒說明進(jìn)行操作分析。BAI1引物序列為，上游引物：5'-CAGAGGAGCAGGTGGACAGAGAAAG-3'，下游引物：5'-TCAGGA GACAGTGGAAGCAGCG-3'。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 腫瘤組織血管密度采用Image pro plus軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理得出數(shù)據(jù)，血管環(huán)周長(zhǎng)用ipp軟件計(jì)算。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖。計(jì)量資料以(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LBP對(duì)CT 26小鼠結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)的影響 見圖1。LBP用藥組CT26 CRC小鼠腫瘤重量為(0.31±0.04)g小于對(duì)照組(0.63±0.06)g(P＜0.05)(圖1B)；繪制腫瘤生長(zhǎng)體積曲線，發(fā)現(xiàn)LBP可抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)(圖1A)。

2.2 LBP對(duì)腫瘤組織血管生成的影響 見圖2。LBP用藥組血管數(shù)(31.6±2.45)條/視野明顯少于對(duì)照組(42.3±3.28)條/視野(P＜0.05)，表明LBP可抑制腫瘤血管的形成。

圖1 LBP對(duì)CT 26小鼠結(jié)直腸癌腫瘤生長(zhǎng)的影響

圖2 LBP對(duì)腫瘤組織血管生成的影響

2.3 LBP對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管形成的影響 見圖3。觀察動(dòng)脈環(huán)周圍新生成的血管數(shù)量，LBP用藥劑量分別在500 μg/mL和1000 μg/mL時(shí)血管數(shù)明顯少于對(duì)照組，表明LBP對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管形成具有抑制作用，且與濃度相關(guān)。

圖3 LBP對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管形成的影響(×60)

2.4 LBP對(duì)CT 26及HDMEC細(xì)胞增殖的影響 見圖4。LBP藥物濃度設(shè)定在0～1000 μg/mL之間，隨著濃度的增加，LBP對(duì)小鼠CRC CT26細(xì)胞(圖4A)及HDMEC細(xì)胞(圖4B)增殖均無明顯的影響。

圖4 LBP對(duì)CT 26及HDMEC細(xì)胞增殖的影響

2.5 LBP對(duì)HDMEC內(nèi)皮細(xì)胞B AI1表達(dá)的影響 見圖5。與對(duì)照組比較，LBP 500 μg/mL及1000 μg/mL處理HDMEC后，BAI1 表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。

圖5 LBP對(duì)HDMEC內(nèi)皮細(xì)胞B A I1表達(dá)的影響

3 討論

惡性腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因，血管形成為腫瘤細(xì)胞提供了豐富的氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為促進(jìn)其惡性生物學(xué)行為創(chuàng)造了條件[5]。抗血管生成藥物通過切斷惡性腫瘤細(xì)胞的養(yǎng)分補(bǔ)給，并阻斷侵襲轉(zhuǎn)移的血行通道，使腫瘤細(xì)胞靜止于休眠狀態(tài)，因此，以抑制腫瘤血管形成為目的生物治療受到廣大研究者關(guān)注。

研究證實(shí)許多中藥具有抗血管作用，例如蜂毒素、去甲斑蝥素、蟾毒靈三種抗腫瘤中藥對(duì)人體肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)均有不同程度抑制作用，在一定范圍內(nèi)呈濃度和時(shí)間的依賴性，雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)三種藥物不同濃度均能抑制腫瘤血管形成[6]。潘子民等[7]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可通過下調(diào)腫瘤VEGF2 mRNA及蛋白的表達(dá)量，阻滯腫瘤血管生成。中醫(yī)藥治療腫瘤具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，以及價(jià)格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，可彌補(bǔ)靶向抗腫瘤血管治療方面的缺陷，從而為腫瘤的治療開辟更好的途徑。

課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LBP可抑制肝癌模型小鼠VEGF的表達(dá)[2]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)LBP可抑制自發(fā)乳腺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)及減少腫瘤間質(zhì)血管形成[4]。本研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用CT26結(jié)直腸癌小鼠腫瘤模型，LBP整體給藥情況下，與對(duì)照組比較，LBP對(duì)結(jié)腸癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)亦具有一定的抑制作用，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)血管在用藥后明顯減少。進(jìn)一步通過大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LBP可抑制血管形成；但體外細(xì)胞培養(yǎng)，CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)卻沒有發(fā)現(xiàn)LBP對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26及HDMEC增殖的抑制作用，說明LBP對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與直接殺傷腫瘤細(xì)胞或者抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖無明顯的關(guān)系，有可能是通過一些復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境因素抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管的形成。BAI1特異性表達(dá)在腦組織內(nèi)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體的B家族，具有抑制血管生成作用[8]。QPCR檢測(cè)LBP可促進(jìn)BAI1表達(dá)上調(diào)，其抑制血管形成機(jī)制是否是通過上調(diào)BAI1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，還需要進(jìn)一步探明。由于中藥抗腫瘤作用具有多靶點(diǎn)的特征，其體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)及抑制血管形成的具體機(jī)制需要深入研究。