于夢(mèng)嬌 韓蘇蘇 高蓬勃 孫麗萍

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2 廣西大學(xué)，南寧 530004；3 山東五蓮食品藥品監(jiān)督管理局，日照 262300）

蜂膠是蜜蜂從植物的嫩芽與樹干上采集的樹膠與其上顎腺分泌物和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]，是一種傳統(tǒng)的用于治療多種疾病的民間藥材，含有多種化學(xué)成分。具有抑菌[2]、抗病毒[3,4]、消炎[5]、止齲、抗癌[6,7]、抗氧化[8]、增強(qiáng)免疫力[9]、降血糖[10]等保護(hù)身體健康、抵御疾病入侵的作用，作為一種保健食品，應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品等行業(yè)，流行于世界各地。蜂膠的成分主要依賴于蜜蜂所采集樹脂的植物，受季節(jié)、氣候、蜜蜂種類、采集方法等因素的影響[11-14]。由于世界各地的膠源植物不同，植物種類存在明顯差異，所產(chǎn)生樹脂的化學(xué)成分相差很大[12-14]，因此世界各地的蜂膠成分也不相同，其化學(xué)成分具有十分明顯的地域性[15]，對(duì)某一產(chǎn)地蜂膠的研究結(jié)論往往不適用于其他產(chǎn)地的蜂膠，要實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂膠品質(zhì)的監(jiān)控，必須對(duì)不同產(chǎn)地的蜂膠成分進(jìn)行研究[15]。

目前國內(nèi)外已有不少對(duì)蜂膠中有效成分提取及含量分析的報(bào)道文獻(xiàn)[16-18]，有文獻(xiàn)報(bào)道[19]了對(duì)于中國蜂膠的總酚、黃酮含量的測定，但對(duì)于馬來西亞無刺蜂蜂膠和巴西綠蜂膠文獻(xiàn)的報(bào)道僅僅是分離得到總酚、黃酮和萜類成分[20-22]，未見3類成分含量測定的報(bào)道，更未見3地蜂膠3類成分差異的報(bào)道。

因此，本文通過紫外分光光度法對(duì)馬來西亞、巴西、中國3種不同產(chǎn)地的蜂膠進(jìn)行成分含量分析，用紫外分光光度法對(duì)這3種不同產(chǎn)地的33個(gè)蜂膠樣品的總酚類、黃酮類和萜類含量進(jìn)行測定分析，并且通過聚類分析對(duì)測定的含量差異進(jìn)行分析，以期為研究不同地域蜂膠的特征組分分類、不同地域蜂膠成分和不同地域蜂膠的質(zhì)量控制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

馬來西亞無刺蜂蜂膠10個(gè)（編號(hào)M1-M10），采自馬來西亞Sarawak州Sibu的常青蜂場，地處Nanga Dap森林，Kanowit，東經(jīng)2°，北緯112°；巴西綠蜂膠6個(gè)（編號(hào)B1-B6），由江蘇江大源健康科技股份有限公司提供；中國蜂膠16個(gè)，包括東北蜂膠7個(gè)（編號(hào)D1-D7）和華北蜂膠9個(gè)（編號(hào)H1-H9），由各定地蜂場采集。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品：源葉生物B21403，HPLC≥98%；香草醛：Solarbio北京索萊寶科技有限公司，SV8230；福林酚；碳酸鈉；三氯化鋁；高氯酸、冰醋酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津），MS 304/S電子天平（梅特勒-托利多）；恒溫水浴鍋（蘇州金壇市中大儀器廠）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蜂膠醇提液制備

33個(gè)蜂膠樣品經(jīng)-70℃冷凍后粉碎，精密稱量1.6g（精確至0.0001g），加入50ml無水乙醇，超聲提取10min，放置2h再超聲提取10min，總共超聲提取3次，過濾定容至50ml，備用。

2.2 萜類含量測定標(biāo)線[23-25]

用無水乙醇將熊果酸配成0.10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取0.70、0.90、1.10、1.30、1.50、1.70ml，水浴蒸干后，加5%香草醛-冰醋酸0.40ml（現(xiàn)配現(xiàn)用），加高氯酸1.00ml，混勻，密閉條件下在60℃水浴中反應(yīng)10min，即刻冰浴冷卻3min，加冰醋酸定容至10ml，搖勻。用分光光度計(jì)在544nm波長下測定吸光度值，以熊果酸濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度的差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：取一定體積的蜂膠醇提液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，結(jié)果用平均值±SD表示。

體育小鎮(zhèn)投資門檻較高，對(duì)于一般企業(yè)來說沒有相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)能力來承擔(dān)建設(shè)費(fèi)用，所以小鎮(zhèn)的投資者多為產(chǎn)業(yè)龍頭企業(yè)，如萬科建造的冰雪小鎮(zhèn)、恒大建造的足球小鎮(zhèn)等。面對(duì)這樣的市場環(huán)境狀況，培育多元市場主體、優(yōu)化資源配置是在全國范圍內(nèi)建造體育小鎮(zhèn)的關(guān)鍵所在。

2.3 總酚含量測定標(biāo)線[26]

精準(zhǔn)稱取一定量的碳酸鈉，加入去離子水，配制得到20%的碳酸鈉溶液備用。準(zhǔn)確稱量一定量的沒食子酸，用95%的乙醇定容至10ml，制成0.10mg/ml的溶液。吸取該溶液0.15、0.20、0.25、0.30、0.35ml分別置于5ml容量瓶內(nèi)，各加入3ml去離子水，0.25ml Folin phenol試劑，搖勻，靜置5min，再各加入0.75ml 20%的碳酸鈉溶液，用去離子水定容至5ml，混合均勻，常溫下避光靜置30min。在763nm波長下測定吸光值，以沒食子酸濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：取一定體積的蜂膠醇提液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，結(jié)果用平均值±SD表示。

2.4 黃酮含量測定標(biāo)線[26]

精密稱量三氯化鋁配制成1%的三氯化鋁乙醇溶液。精密稱取蘆丁對(duì)照品1mg，用95%的乙醇定容至10ml，制成100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取該溶液0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00ml各加入1.00ml 1%三氯化鋁乙醇溶液，用95%乙醇溶液定容至10ml，混合均勻，靜置10min。在405nm波長下測定吸光值，以蘆丁濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。

樣品測定：取一定體積的蜂膠醇提液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，結(jié)果用平均值±SD表示。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件聚類分析中的最短距離法進(jìn)行聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 3種不同產(chǎn)地蜂膠總酚、黃酮和萜類含量分析

采用紫外分光光度法測定3種不同產(chǎn)地的33個(gè)蜂膠樣品的總酚、黃酮和萜類含量，結(jié)果見表1。

如表1所示，3種不同產(chǎn)地蜂膠的總酚含量相差很大，中國蜂膠總酚含量最高，高達(dá)143.565mg/g；馬來西亞蜂膠的總酚含量最低，僅為11.624mg/g，不到中國蜂膠總酚含量的1/10；巴西綠蜂膠總酚含量介于中國蜂膠與馬來西亞蜂膠之間，為81.299mg/g。

表1 3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品總酚、黃酮和萜類含量（mg/g）

與上述兩指標(biāo)相同，3種不同產(chǎn)地蜂膠的萜類含量相差也很大，馬來西亞蜂膠萜類含量高達(dá)335.022mg/g，位列第一；中國蜂膠的萜類含量最低，僅為76.636mg/g，不到馬來西亞蜂膠萜類含量的1/4；巴西綠蜂膠萜類含量介于馬來西亞蜂膠與中國蜂膠之間，均值為168.795mg/g，約為中國蜂膠的2倍多，略多于馬來西亞蜂膠的一半。

通過對(duì)3種不同產(chǎn)地的33個(gè)蜂膠樣品的總酚、黃酮、萜類含量的測定分析發(fā)現(xiàn)，馬來西亞無刺蜂蜂膠、巴西綠蜂膠和中國蜂膠三者成分明顯不同，中國蜂膠以高含量的總酚和黃酮為特征，這與Gardana C等[27,28]人報(bào)道的中國蜂膠以多酚和類黃酮為主要成分相吻合；馬來西亞無刺蜂蜂膠以高含量的萜類為特征，這與Nurhamizah Ibrahim等[21]人的報(bào)道一致，究其原因可能是馬來西亞無刺蜂蜂膠主要來源于熱帶植物，其中萜烯類化合物是這種蜂膠中主要的活性成分[21]；而巴西綠蜂膠中這3類成分含量比較均勻，與中國蜂膠、馬來西亞蜂膠相比沒有明顯特征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)[29,30]均表明來自不同國家和地區(qū)的蜂膠的化學(xué)成分確實(shí)存在差異，成分的差異會(huì)帶來活性的差異，在研制不同產(chǎn)地蜂膠產(chǎn)品時(shí)需加以注意。

3.2 3種不同產(chǎn)地蜂膠總酚、黃酮和萜類含量的聚類分析

3.2.1 總酚類含量的聚類分析

為了更加清晰的比較這3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品總酚類含量之間的關(guān)系，對(duì)測定結(jié)果做了聚類分析，結(jié)果見圖1。

如圖1所示，馬來西亞10個(gè)蜂膠樣品（M系列）總酚含量的聚合度非常高；巴西綠蜂膠中4個(gè)樣品（B1、B2、B3、B6）總酚含量的聚合度也非常高，另2個(gè)樣品（B4、B5）總酚含量與中國蜂膠樣品總酚含量具有較高的聚合度，而3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品總酚含量之間的聚合度卻很低，具有明顯的差異，其中馬來西亞蜂膠樣品與另外2種蜂膠樣品的總酚含量聚合度非常低，說明相同產(chǎn)地蜂膠樣品的總酚含量差異不大，而不同產(chǎn)地蜂膠樣品的總酚含量差異比較大。因此，可以用總酚這個(gè)指標(biāo)將馬來西亞蜂膠與巴西綠蜂膠、中國蜂膠加以區(qū)分，而巴西蜂膠樣品的總酚含量與中國蜂膠相近，聚合度較高，不能用總酚這一指標(biāo)加以區(qū)分，需要接下來進(jìn)一步研究，較為全面地了解蜂膠更多的有用信息，以期通過其他方法將兩者區(qū)分開。

圖1 3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品總酚含量的聚類分析圖

圖2 3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品黃酮含量的聚類分析圖

3.2.2 黃酮類含量的聚類分析

為了更加清晰的比較這3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品黃酮類含量之間的關(guān)系，對(duì)測定結(jié)果做了聚類分析，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，馬來西亞（M系列）的10個(gè)蜂膠樣品與巴西、中國這2個(gè)產(chǎn)地的蜂膠黃酮含量的聚合度很差。相比其他2種蜂膠黃酮含量，馬來西亞的10個(gè)蜂膠樣品（M系列）黃酮含量比較少，可以通過黃酮含量將馬來西亞蜂膠與巴西綠蜂膠、中國蜂膠加以區(qū)分，而巴西蜂膠的黃酮含量與中國蜂膠的聚合度較高，通過聚類分析結(jié)果看差異不明顯，不能用黃酮這一指標(biāo)進(jìn)行區(qū)分，這就需要接下來進(jìn)一步研究，較為全面地了解蜂膠更多的有用信息。

3.2.3 萜類含量的聚類分析

為了更加清晰的比較這3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品萜類含量之間的關(guān)系，對(duì)測定結(jié)果做了聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 3種不同產(chǎn)地蜂膠樣品萜類含量的聚類分析圖

如圖3所示，17個(gè)中國蜂膠樣品萜類含量的聚合度很高，具有高度一致性。與此同時(shí)，馬來西亞的10個(gè)蜂膠樣品（M系列）萜類含量的聚合度非常高，巴西綠蜂膠的6個(gè)蜂膠樣品（B系列）萜類含量的聚合度也非常高，說明來自同一個(gè)產(chǎn)地的蜂膠樣品萜類含量比較相近，從而可以根據(jù)萜類含量對(duì)不同產(chǎn)地的蜂膠樣品進(jìn)行分類，為不同產(chǎn)地蜂膠樣品的分類提供了依據(jù)。另外，巴西綠蜂膠（B1-B4）的萜類含量與中國蜂膠萜類含量的聚合度較高，巴西綠蜂膠（B5、B6）的萜類含量與馬來西亞（M系列）蜂膠的聚合度較高，說明通過萜類含量可以將馬來西亞蜂膠與巴西綠蜂膠、中國蜂膠這三者區(qū)分開。

通過對(duì)上述總酚、黃酮、萜類這3個(gè)指標(biāo)含量的聚類分析發(fā)現(xiàn)，這3類成分在不同種的蜂膠樣品中相對(duì)含量差異較大，可以通過這3種成分的含量對(duì)這3個(gè)地域的蜂膠加以區(qū)分。蜂膠的總酚類、黃酮類、萜類成分與地域來源具有關(guān)聯(lián)性，從而可以推測根據(jù)蜂膠的這3類成分的差異來判定其來源。

4 小結(jié)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，中國、巴西和馬來西亞3地蜂膠的萜類、總酚、黃酮含量差異很大；其中馬來西亞蜂膠萜類含量最高，平均每g蜂膠可達(dá)335.022mg，總酚和黃酮含量為三者最低；中國蜂膠含有高含量的總酚和黃酮類成分，萜類含量最低；巴西綠蜂膠的萜類、總酚、黃酮含量在3地樣品中表現(xiàn)均衡，既沒有馬來西亞蜂膠的高萜類特征，也沒有中國蜂膠的高酚類及黃酮特征。通過聚類分析可知用萜類指標(biāo)可以明確將馬來西亞蜂膠、巴西綠蜂膠和中國蜂膠相互區(qū)分開。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究不同地域蜂膠的特征組分分類、不同地域蜂膠成分和不同地域蜂膠的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。