陳道印 劉新宇 高寶國(guó) 周姝婧 朱翔杰 徐新建 郝璐楠 周冰峰

（1 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002；2 陜西榆林市草原工作站，榆林 719000；3 陜西榆林市種蜂場(chǎng)，榆林 719000）

蜜蜂是自然界以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常重要的授粉昆蟲(chóng)，具有重大的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。榆林市位于我國(guó)陜西省北部，屬于典型的黃土高原地貌，是我國(guó)重要的刺槐、棗花以及蕎麥蜜源區(qū)[4]。上世紀(jì)80年代，全國(guó)東方蜜蜂資源調(diào)查顯示我國(guó)東方蜜蜂在陜西省北部主要分布于長(zhǎng)城以南，榆林市是東方蜜蜂分布的邊緣區(qū)之一[5]。我們?cè)?0個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)榆林市的靖邊、子洲東方蜜蜂進(jìn)行遺傳分析，研究分布邊緣區(qū)域東方蜜蜂的遺傳多樣性和遺傳分化，發(fā)現(xiàn)靖邊的東方蜜蜂與黃土高原其他地區(qū)存在種群遺傳分化，靖邊、子洲的東方蜜蜂微衛(wèi)星遺傳多樣性水平低于黃土高原其他地區(qū)[6]。靖邊東方蜜蜂曾于2009年8月初爆發(fā)蜜蜂大量死亡事件[7,8]，靖邊蜂農(nóng)所飼養(yǎng)的東方蜜蜂中有近半蜂群死亡[8]，種群數(shù)量的下降往往會(huì)帶來(lái)遺傳多樣性的喪失，威脅種群的生存。

微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite）又被稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR），因其具有數(shù)量多、變異豐富、容易檢測(cè)等特點(diǎn)[9]，已被廣泛應(yīng)用于種群遺傳研究。前人應(yīng)用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記對(duì)秦巴山區(qū)[10]、長(zhǎng)白山[11]、黃土高原[6]、海南[12]、浙江[13]等地區(qū)的東方蜜蜂進(jìn)行了種群遺傳分化和遺傳多樣性研究。以前由于受分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制，東方蜜蜂微衛(wèi)星種群遺傳分析所使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)較少，只有5～10個(gè)。隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，增加微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量對(duì)研究東方蜜蜂種群遺傳既可行也必要。

本文利用38個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記對(duì)陜西省榆林市東方蜜蜂進(jìn)行種群遺傳分析，評(píng)估遺傳多樣性水平。探索分布在邊緣區(qū)域的東方蜜蜂在黃土高原生境條件下的遺傳分化規(guī)律和遺傳多樣性科學(xué)規(guī)律，為榆林東方蜜蜂遺傳資源的保護(hù)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年采集榆林市共7個(gè)樣點(diǎn)，390群東方蜜蜂（圖1）。神木是我們采集的最北部樣點(diǎn)，只采集到5群蜜蜂的樣本，均為野生蜂群。其余6個(gè)樣點(diǎn)采自不受人為選育影響的原始飼養(yǎng)蜂群，樣本量分別為榆陽(yáng)43群，佳縣66群，吳堡31群，綏德83群，清澗79群，靖邊83群。

圖1 榆林市各樣點(diǎn)分布示意圖

1.2 DNA提取與目標(biāo)片段擴(kuò)增

每個(gè)蜂群提取1只工蜂的基因組，使用Ezup柱式基因組提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，每個(gè)樣本均使用38對(duì)SSR引物（Ac-2、Ac-5、Ac-26、Ap085、AT101、Ac045、K1458、AT165、UN117、AP208、SV039、BI314、K0715、SV220、AP243、BI278、AP066、SV066、AP148、AP042、AT109、BI216、SV261、AT185、AP249、AC139、UN373、AC011、AT103、AP189、UNEV2、BI225、UN270、244T、Ap313、Ac-1、Ac-35、AT004）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14,15]。PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730xl自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行基因分型與測(cè)序，獲得SSR基因型數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

評(píng)估2017年所采集樣本的遺傳分化狀況：Genepop on web分析2017年新采集的各樣點(diǎn)之間的遺傳分化系數(shù)（Fst）[16]，并基于Fst計(jì)算基因流參數(shù)Nm，Nm=1/4（1/Fst-1）[17]；Structure 2.3.4進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析[18]，生成的結(jié)果借助Structure hawester計(jì)算最佳分化K值；使用R 3.3.2軟件包使用樣點(diǎn)作為先驗(yàn)分組進(jìn)行主成分判別分析（DAPC）驗(yàn)證分化結(jié)果[19]。

評(píng)估所采集的所有樣本的種群遺傳多樣性水平：Excel Micro-Satellite Toolkit 3.1進(jìn)行雜合度（He，Ho）、等位基因數(shù)（Na）以及多態(tài)信息含量（PIC）的計(jì)算[20]；PopGene 1.31軟件進(jìn)行有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)指數(shù)（I）的計(jì)算[21]；Fstat 3.2軟件計(jì)算等位基因豐富度（Rs）與近交固定系數(shù)（Fis）[22]。

統(tǒng)計(jì)所有樣本的遺傳結(jié)構(gòu)：GenAlex 6.503進(jìn)行等位基因型以及等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)[23]，神木樣點(diǎn)由于樣本數(shù)量過(guò)少并未納入統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 榆林東方蜜蜂遺傳分化

根據(jù)樣點(diǎn)間的遺傳分化系數(shù)、Structure分析、DAPC分析等研究，發(fā)現(xiàn)榆林東方蜜蜂分化為3個(gè)種群，分別為靖邊種群、綏德-清澗種群以及佳縣-吳堡-榆陽(yáng)-神木種群。

在Structure分析中，最佳K值為3（圖2），靖邊樣點(diǎn)為獨(dú)立的一個(gè)分組，綏德、清澗被分為一組，神木、榆陽(yáng)、佳縣、吳堡4個(gè)樣點(diǎn)被分為一組（圖3）。

圖2 榆林東方蜜蜂Structure最佳分組ΔK曲線(xiàn)圖

圖3 榆林東方蜜蜂微衛(wèi)星遺傳結(jié)構(gòu)

圖4 基于38個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的榆林東方蜜蜂DAPC結(jié)果圖

使用DAPC分析按樣點(diǎn)進(jìn)行分組檢驗(yàn)，結(jié)果顯示靖邊為獨(dú)立的一組，佳縣-吳堡-榆陽(yáng)-神木為一組，綏德-清澗完全重疊為一組（圖4）。

遺傳分化系數(shù)（Fst）以及基因流（Nm）的分析結(jié)果（表1）表明，靖邊與神木、榆陽(yáng)、佳縣、吳堡之間的Fst在0.0539～0.1083之間。根據(jù)Wright所提出的當(dāng)Fst＞0.05時(shí)表明兩個(gè)種群存在遺傳分化的標(biāo)準(zhǔn)[24]，靖邊與神木、榆陽(yáng)、佳縣、吳堡之間存在著明顯的分化。

2.2 榆林東方蜜蜂的遺傳多樣性

遺傳多樣性參數(shù)分析顯示榆林東方蜜蜂南部樣點(diǎn)的遺傳多樣性普遍高于北部樣點(diǎn)，分布于榆林東部的6個(gè)樣點(diǎn)在期望雜合度（He）上由南到北逐漸降低，而位于南部種群的綏德、清澗樣點(diǎn)在有效等位基因數(shù)量（Ne）、香農(nóng)指數(shù)（I）、等位基因豐富度（Rs）以及多態(tài)信息含量（PIC）上要明顯高于北部種群各個(gè)樣點(diǎn)。

比較該區(qū)域各樣點(diǎn)的觀(guān)察雜合度（Ho）與期望雜合度（He），綏德、清澗、靖邊、吳堡以及榆陽(yáng)5個(gè)樣點(diǎn)的觀(guān)察雜合度（Ho）低于期望雜合度（He），近交系數(shù)（F-is）均大于0。

2.3 榆林東方蜜蜂的微衛(wèi)星遺傳結(jié)構(gòu)

榆林市各個(gè)種群的東方蜜蜂在9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上表現(xiàn)出不同的遺傳結(jié)構(gòu)。在位點(diǎn)Ap085上，佳縣與吳堡樣點(diǎn)主要以a187（0.389～0.409）為優(yōu)勢(shì)等位基因，而其他樣點(diǎn)等位基因分布較為分散。在位點(diǎn)AT101上，佳縣、吳堡與榆陽(yáng)以a246（0.5～0.583）為優(yōu)勢(shì)等位基因，靖邊、綏德、清澗則以a244（0.259～0.462）、a245（0.231～0.398）為優(yōu)勢(shì)等位基因。在位點(diǎn)AC045上，綏德、清澗擁有相對(duì)較高的a142比例（0.120～0.175）。在位點(diǎn)AP243中，佳縣、吳堡、榆陽(yáng)以a257為優(yōu)勢(shì)等位基因（0.326～0.492），其余樣點(diǎn)的等位基因比較分散并無(wú)優(yōu)勢(shì)等位基因。在SV066中，靖邊的a185占比在0.97左右，其余樣點(diǎn)則擁有相對(duì)較高的a180比例（0.105～0.241）。在位點(diǎn)AP042中，綏德、清澗的a139（0.095～0.211）擁有相對(duì)較高的頻率，其余樣點(diǎn)幾乎僅以a143為唯一等位基因。在位點(diǎn)AC011中，榆陽(yáng)、佳縣、吳堡擁有相對(duì)較低的a134（0～0.038），其余樣點(diǎn)的a134在0.108～0.171之間。在位點(diǎn)AP189中，靖邊以a120（0.367）、a122（0.349）為優(yōu)勢(shì)等位基因，其余樣點(diǎn)則以a118（0.339～0.535）為優(yōu)勢(shì)等位基因。在位點(diǎn)244T中，靖邊主要以a189（0.228）、a197（0.321）為優(yōu)勢(shì)等位基因，其余樣點(diǎn)則以a189（0.171～0.417）、a191（0.169～0.317）、a193（0.037～0.274）為優(yōu)勢(shì)等位基因（表3）。

表1 榆林東方蜜蜂遺傳分化系數(shù)與基因流

表2 榆林東方蜜蜂遺傳多樣性水平參數(shù)信息

表3 榆林東方蜜蜂樣點(diǎn)之間存在差異位點(diǎn)的等位基因頻率表

3 討論

3.1 榆林東方蜜蜂的遺傳多樣性水平

遺傳多樣性是物種進(jìn)化的基礎(chǔ)[25]，因此遺傳多樣性評(píng)估對(duì)于遺傳資源的鑒定以及保護(hù)有著非常重要的意義。榆林市南部東方蜜蜂種群的遺傳多樣性普遍高于北部種群的多樣性水平。利用本研究與其他研究中相同的8個(gè)SSR位點(diǎn)（Ac1、Ac2、Ac5、Ac26、Ac35、Ap085、A313、AT101）進(jìn)行期望雜合度的計(jì)算與比對(duì)，海南的平均期望雜合度為0.5970[12]，黃土高原其他樣點(diǎn)的平均期望雜合度為0.6781[6]，秦巴山區(qū)的平均期望雜合度為0.6877[10]，榆林市的平均期望雜合度為0.6297，表明榆林市東方蜜蜂遺傳多樣性水平在黃土高原較低，也低于秦巴山區(qū)東方蜜蜂的遺傳多樣性水平。

榆林市植被分布由南到北逐漸稀疏，僅于部分溝壑中可能存在有樹(shù)洞的喬木，這意味著榆林野生東方蜜蜂的營(yíng)巢條件受到限制，影響當(dāng)?shù)貣|方蜜蜂的自然種群數(shù)量，使得榆林東方蜜蜂的遺傳多樣性呈現(xiàn)較低水平。生境破碎化造成東方蜜蜂分布的破碎化，影響各種群間的基因交流，使種群內(nèi)的東方蜜蜂存在一定程度的近交現(xiàn)象，喪失部分遺傳多樣性。有觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為中蜂囊狀幼蟲(chóng)病能夠?qū)е聳|方蜜蜂在某些位點(diǎn)上的等位基因大量丟失，造成遺傳多樣性的降低[10]。據(jù)采樣時(shí)了解到，榆林市部分縣市曾爆發(fā)中蜂囊狀幼蟲(chóng)病，這可能也是造成榆林市東方蜜蜂種群遺傳多樣性較低的原因之一。

3.2 榆林東方蜜蜂的遺傳分化機(jī)制

榆林市屬于典型的黃土高原地貌，氣候干燥，植被稀疏，生態(tài)環(huán)境極為脆弱[26]，境內(nèi)生境破碎化嚴(yán)重[27]。生境破碎影響種群分布，阻礙種群間基因流，促使種群發(fā)生分化[28]。榆林所發(fā)現(xiàn)的3個(gè)種群之間直線(xiàn)距離均在30km以上，蜜蜂最遠(yuǎn)的婚飛距離是15km[29]，而各個(gè)種群之間缺乏野生東方蜜蜂營(yíng)巢條件，也沒(méi)有蜂場(chǎng)，從而限制了各個(gè)種群之間東方蜜蜂的遷移，從而阻斷了種群間的基因流，造成各個(gè)種群間發(fā)生種群遺傳分化。