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結核病嚴重危害人類健康，是我國重點防控的重大疾病之一。近年來，人口流動的增加和耐藥結核分枝桿菌的增多更加劇了結核病在人群間的傳播，因此必須加強對結核病有效的控制和監(jiān)測。分子流行病學，尤其是基因分型方法是監(jiān)測結核病流行和傳播的有效手段。

間隔區(qū)寡核苷酸分型法(spacer oligonucletide typing,spoligotyping)是一項用于鑒別結核分枝桿菌家族遺傳的技術，由于其有可靠、高效等特點，因此被廣泛采用，特別在北京家族菌株中[1-2]。目前，多個亞洲國家分離的結核分枝桿菌的基因分型結果表明，北京基因型是主要流行基因型[3]。此外，北京基因型在俄羅斯也是優(yōu)勢基因型[4]，但是，在芬蘭、丹麥等北歐國家卻很少發(fā)現(xiàn)[5]。而在我國南方，北京基因型的比例會有所降低，其它基因型例如T家族、Haarlem H3基因型、MANU家族菌株，U型及H型家族等菌株會有增多[6-8]。而在先前的報道中，北京基因型導致了耐多藥結核病的暴發(fā)，一些研究推測，北京基因型與耐藥性相關[1，9]。廣東省是一個人口流動大省，結核病的疫情比較復雜，耐藥情況比較嚴重，為了解廣東地區(qū)各種基因型與耐藥性的關系，作者收集廣州市胸科醫(yī)院的504株來自廣東省各地區(qū)的結核分枝桿菌臨床分離株，采用spoligotyping方法進行基因分型，比例法進行常規(guī)抗結核藥耐藥性檢測，并對各基因型及耐藥情況進行分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 隨機數(shù)字表法從廣州市胸科醫(yī)院結核分枝桿菌菌株庫中選取504株廣東省不同地區(qū)近年在臨床上分離的結核分枝桿菌菌株，包括廣州市302株、東莞12株、佛山8株、河源14株、惠州6株、江門1株、揭陽24株、羅定3株、茂名13株、梅州8株、普寧1株、清遠16株、汕頭18株、潮汕1株、潮州2株、汕尾25株、韶關5株、深圳5株、陽江5株、云浮7株、湛江14株、漳州1株、肇慶4株、中山7株、珠海2株，經(jīng)轉種后備用。

1.2主要儀器與試劑 1)SAN96 熔解曲線檢測儀、BACTEC MGIT 960系統(tǒng)、Lab-Aid 820核酸提取儀。2)結核分枝桿菌McSpoligotyping分型檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)、DNA提取液及 DNA提取磁珠條購于廈門致善生物科技公司；7H9培養(yǎng)藥敏管購自BD公司。

1.3藥敏及菌種鑒定方法 結核分枝桿菌參照《分枝桿菌藥物敏感性測定標準化操作程序》[10]進行藥敏試驗，異煙肼(Isoniazid,INH)、鏈霉素(Streptomycin,SM)、利福平(Rifampin，RFP)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide, PZA)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)、阿米卡星(Amikacin, AMK)藥敏試驗采用 MGIT 960 法，待儀器自動報告結果時，記錄報陽時間并分析結果； 菌種鑒定方法采用晶芯基因芯片法。

1.4DNA提取 用接種環(huán)(22 SWG標準接種環(huán))挑取一環(huán)(5-10 mg)在羅氏培養(yǎng)基上生長良好的結核分枝桿菌菌落于200μL DNA提取液中，渦旋震蕩器震蕩破碎，99 ℃滅菌20 min，采用磁珠法于核酸提取儀中提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5基因分型 采用熔解曲線間隔區(qū)寡核苷酸分型(Melting curve Spoligotyping， McSpoligotyping)法。結核分枝桿菌基因組序列設計熒光PCR引物序列，引物序列信息為DRa：5′-GGT TTT GGG GAC GAC-3′,DRb：5′-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3′。根據(jù)廈門致善結核分枝桿菌McSpoligotyping分型檢測試劑盒使用說明，選擇結核分枝桿菌所攜帶的43個特異的間隔區(qū)(Spacer)作為檢測模型。首先，在高度同源的同向重復序列(DR, direct repeat)上設計一對通用引物，并利用這對通用引物擴增出間隔區(qū)(S1～S43)的PCR產(chǎn)物；其次，根據(jù)每個間隔區(qū)的DNA序列設計能夠與之特異雜交的熒光探針。每條熒光探針都帶有特征性的熒光標記和熔點溫度組合。當PCR產(chǎn)物中存在某一間隔區(qū)序列時，相應的熒光探針就能與之雜交形成特征的熔解曲線峰；最后，通過這些熔解曲線峰的組成確認待檢樣品中所存在的間隔區(qū)，從而推斷樣品中所攜帶的結核分枝桿菌型別。其擴增、熔解曲線分析程序如下：95 ℃預熱 5min→95 ℃解鏈 10S→57 ℃退火15S→76 ℃ 延伸10S，共50個循環(huán)→95 ℃ 3 min→35 ℃ 1 min，35 ℃ ∽90 ℃以0.04 ℃/S的升溫速率進行熔解曲線分析，且此階段采集FAM、HEX、ROX和CY5通道熒光信號。

1.6質量控制 在結核分枝桿菌復合群GyrA基因的序列片段上設計一對擴增引物及相應的檢測探針，作為體系的內(nèi)控指示樣品質量是否合格。采用標準菌株H37RV結核分枝桿菌及BCG分枝桿菌做質量控制菌株。

1.7統(tǒng)計學與分析 Mcspoligotyping 的基因分型數(shù)據(jù)交國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus(http://www.miru-vntrplus.org)[11]和SpolDB4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITD_ONLINE)[12]。采用BioNumerics5.0進行聚類分析，不同基因型的構成比和耐藥率運用SPSS19.0軟件進行卡方檢驗等進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1廣東省地區(qū)結核分枝桿菌的種類 504株經(jīng)晶芯基因芯片鑒定證實為結核分枝桿菌采用Mcspoligotyping法分型，分為北京基因型和非北京基因型兩大類，其中北京基因型菌株為386株，占76.6%，非北京基因型菌株118株，占23.4%。其中非北京基因型包括T家族48株，占9.5%(48/504)；H3家族11株，占2.2%(11/504)；EAI家族7株，占1.4%(7/504)；MANU家族6株，占1.2%(6/504)；LAM9 4株，占0.8%(4/504)；AMBIGO 4株，占0.8%(4/504)；CAS1-Delhi 1株，占0.2%(1/504);新發(fā)現(xiàn)基因型37株，占7.3%(37/504)。

2.2廣東省地區(qū)主要寡核苷酸分型類型 對獲得的寡核苷酸基因分型數(shù)據(jù)進一步分類，504株分離株共歸屬于77種不同寡核苷酸分型類型，其中49種在SPOIDB 4.0數(shù)據(jù)庫中可以檢索到，另外有28種屬于新發(fā)現(xiàn)的寡核苷酸分型類型。通過使用BioNumerics 聚類分析，453株歸類于30個簇中，成簇菌株比例為83.93%{(453-30)/504}。見圖1。在成簇的30種基因型內(nèi)，有79.76%(402/504)的分離株屬于5種主要的流行簇，數(shù)據(jù)庫的SIT編號為：SIT1(北京基因型)370株，占73.41%(370/504);SIT53(T1基因型)15株，占2.98%(15/504)；SIT52(T2基因型)7株，占1.39%(7/504)、SIT19(EAI2-Ma基因型)5株、SIT523(Manu-ar基因型)5株，分別占0.99%(5/504)。

圖1 結核分枝桿菌寡核苷酸分型聚類圖Tab.1 Mycobacterium tuberculosis oligonucleotide typing clusterogram

圖2 廣東省地級市504株結核分枝桿菌的北京基因型及非北京基因型分布圖Fig.2 Beijing genotypes and non-Beijing genotypes of 504 strains of Mycobacterium tuberculosis in prefectural cities of Guangdong Province

2.3北京基因型的分布特征 省內(nèi)各地級市的504株結核分枝桿菌北京基因型、非北京基因型的分布見圖2。其中汕頭、汕尾、揭陽、東莞四個地級市的北京基因型比例分別為：50.0%(9/18)、56.0%(14/25)、58.3%(14/24)和41.7%(5/12)，低于廣州市的80.5%(243/302)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.7, 6.8，5.3和8.3,P<0.05)；河源、湛江、茂名、清遠四個地級市的北京基因型比例分別為：57.1%(8/14)、85.7%(12/14)、76.9%(10/13)和93.8%(15/16)，與廣州市的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.1, 0.02，0.1和0.99,P>0.05);余下的地級市因分離菌株數(shù)少于10株不作統(tǒng)計。504株結核分枝桿菌臨床分離株的患者，男性有356人，女性148人，北京基因型在性別的構成比分別為：74.16%(264/356)和82.43%(122/148),無統(tǒng)計學差異(χ2=3.54，P>0.05)。按年齡分段為青少年組(0―20歲)、青年組(21―60歲)、老年組(61―100歲)，北京基因型在上述年齡組的構成比分別為：80.4%(41/51)、76.9%(280/364)和73.0%(65/89),三者間無統(tǒng)計學差異(χ2=2.24,P>0.05)。

2.4北京基因型與耐藥表型的關系 在本研究的504株結核分枝桿菌中有386株為北京基因型(76.6%)， 118株為非北京基因型(23.4%)，上述兩大類基因型結核分枝桿菌的INH、SM、RFP、EMB、PZA、AMK、LVFX的耐藥率及MDR、XDR的比率見圖3。據(jù)統(tǒng)計，其中INH、PZA、AMK的耐藥率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.6, 6.7和4.0,P<0.05)，其余藥物的耐藥性無統(tǒng)計學差異(χ2=1.38,0.01,2.10,3.10,2.26,2.09,P>0.05)。在MDR和XDR菌株中，北京基因型的比例為82.1%(87/106)和90.0%(18/20)。北京家族對比于T家族、H3家族，EAI家族來說，耐藥發(fā)生率高4.7%～40.2%，由于后三者家族的分離例數(shù)較少，無統(tǒng)計比較意義。 MANU與LAM9家族呈現(xiàn)一定抗結核藥耐藥性，耐藥率接近于北京家族。EAI家族菌株耐藥性最低，對以上7種抗結核藥物均敏感(見圖3)。

圖3 結核分枝桿菌基因型各家族的耐藥情況(株%)Fig.3 Resistance of Mycobacterium tuberculosis in each genotypes family(strain%)

2.5廣東省主要流行株的耐藥表型分析(圖4) 選取主要的有代表性的5種基因型，對其進行耐藥情況分析，耐藥結果為以北京基因型SIT1作為對照，其它4種基因型的耐藥表型與SIT1對比分析。數(shù)據(jù)顯示SIT1基因型的INH、PFP、 SM、EMB、 PZA、 AMK、LVFX、MDR、XDR 的耐藥率均高于SIT53(T1)、 SIT52(T2)、 SIT19 (EAI2-Ma)4.3%～26.0% ，而SIT523(MANU-_ar)在 RFP、SM、EMB、MDR的耐藥率方面高于SIT1 13.8%～45.4%。由于SIT1以外的四種基因型例數(shù)太少，沒有統(tǒng)計學比較意義。

圖4 結核分枝桿菌5種基因型的耐藥率(%)情況Fig.4 Resistance rate (%)of 5 genotypes of Mycobacterium tuberculosis

3 討 論

結核病在世界范圍內(nèi)肆虐，其中發(fā)現(xiàn)北京基因型的傳播與流行是其中一大原因，本研究數(shù)據(jù)顯示：廣東省部分地區(qū)的北京基因型分離率為76.6%，流行簇為SIT1，占73.41%，高于北印度、伊朗、南非、越南、泰國[13-17]，接近于西北俄羅斯[18]。相比于國內(nèi)各省，高于云南、香港、臺灣等南方地區(qū)[19-21],低于河南、西藏等西北地區(qū)[22-23]。北京家族基因型在東亞地區(qū)的大規(guī)模流行可能與其強毒力有關，同時也與該地區(qū)人群廣泛接受卡介苗接種密切相關，有研究表明卡介苗接種產(chǎn)生的保護力無法保護人群對北京家族結核分枝桿菌菌株的感染，因此，對北京基因型深入的研究將提升我們對我國主要流行的基因型的理解。

本研究分離的非北京基因型菌株占23.4%，分別為T家族、H3家族、EAI家族、MANU家族、LAM9、AMBIGO、CAS1-Delhi 及新發(fā)現(xiàn)基因型，基因型呈多態(tài)性分布。T家族流行于中南美地區(qū)，EAI家族則主要分布于東南亞和南印度地區(qū)，MANU是北京家族菌株與歐美家族混合感染而成，LAM9是拉丁美洲地中?；蛐?，中國廣東省是一個人口流動大省，與各國貿(mào)易旅游人口流動相關，例如廣州部分地區(qū)就是外國人貿(mào)易的聚居區(qū)，其中有大量的外國人長期居住于此地從事商業(yè)貿(mào)易，特別是來自于非洲、南亞地區(qū)的人群較多，與上述地區(qū)頻繁的人口流動可能導致在非洲、中亞、南亞流行的結核分枝桿菌在廣東地區(qū)的播散。而潮汕人(汕頭、汕尾、揭陽等地)現(xiàn)聚居海外的有一千多萬人口，有“海內(nèi)一個潮州，海外一個潮州”之說，東莞市地區(qū)海外華僑約30萬，是著名的華僑之鄉(xiāng)，上述地區(qū)在世界范圍內(nèi)的人口流動更為頻繁，各國流行的結核菌基因型得到傳播而至非北京基因型的比例在50%左右，基因型更具多態(tài)性分布特征。

不少文獻認為北京基因型與耐藥有相關性[24-25]， 本研究顯示在INH、RFP、EMB、PZA、AMK、LVFX抗結核藥以及MDR、XDR上，耐藥率均高于非北京基因型，研究結果與逄宇相近[25]。其中高于T家族，H3家族，EAI家族。而MANU是北京家族菌株與歐美家族混合感染而成,耐藥率與北京基因型相近。 LAM是拉丁美洲地中海的耐藥基因型，與抗結核藥物具有耐藥相關性，與文獻報道相近[26]。我們將本研究主要的5種基因型進行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)SIT1北京基因型與抗一、二線結核藥有耐藥相關性同時高于SIT53(T1)，SIT52(T2)，SIT19(EAL)。而SIT523(Manu-ar)有耐藥相關性。值得注意的是MDR-TB 和XDR-TB菌株中有82.1%和 90.0% 均為北京家族，由此可見北京家族是引起廣東省耐多藥結核和泛耐藥結核病的主要基因型。

本研究首次采用新型的自動化基因分型方法對結核分枝桿菌菌株的基因型鑒定，于傳統(tǒng)的手動spoligotyping方法相比較，這種方法的自動化程度高，有效減少了人為操作，另一方面，由于自動化的判讀而非通過雜交后的人工判讀，最大程度降低了傳統(tǒng)spoligotyping方法對部分位點雜交非特異信號的誤判，使得研究結果更科學。本研究中僅發(fā)現(xiàn)了7%的新基因型，顯著低于之前的報道[24]，提示我們上述方法良好的應用前景，特別是對于條件有限的實驗室，上述方法有著其更強的優(yōu)勢。

綜上所述，經(jīng)MCspoligotping分型，廣東省部分地區(qū)結核分枝桿菌的基因型呈多態(tài)性，以北京基因型為主要。流行株為國際數(shù)據(jù)庫SITVIT2編號為SIT1基因型.且與抗結核藥物有耐藥相關性，同時是MDR-TB和XDR-TB的主要流行株。對北京基因型結核分枝桿菌的傳播與耐藥機制應引起重視。