王德華， 劉云燕， 李敏然， 苗同國， 任桂芳， 董金紅

河北省石家莊市第五醫(yī)院介入腫瘤科，石家莊 050017

肝細(xì)胞肝癌(簡稱肝癌)作為一種高危惡性腫瘤，全球發(fā)病率占惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，致死率占惡性腫瘤致死率的第3位[1]。由于肝癌早期癥狀不明顯，且進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，而此時(shí)鮮有有效治療手段。近年來，索拉非尼在晚期肝癌患者的治療中發(fā)揮了重要作用。索拉非尼作為一種多靶向激酶抑制劑，是目前唯一被批準(zhǔn)用于經(jīng)皮肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)失敗后或極末期肝癌治療的藥物[2]。然而，研究[3]顯示，索拉非尼對晚期肝癌患者的有效率僅30%，且患者常在用藥6個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生耐受。因此，尋找有效增強(qiáng)索拉非尼抗腫瘤效應(yīng)的方法并探索其機(jī)制顯得急迫而重要。

腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)使其呈現(xiàn)不同于正常細(xì)胞依賴葡萄糖酵解供能的代謝模式[4-5]，糖酵解產(chǎn)生的能量被用于腫瘤的快速擴(kuò)增與遷移。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞代謝模式的差異有望成為調(diào)控腫瘤生長的靶點(diǎn)。而葡萄糖通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入正?；蚰[瘤細(xì)胞是糖酵解的第1步。根皮苷是一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，本研究探討了其對索拉非尼抗腫瘤效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人HepG2細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物研究所；血清、培養(yǎng)基購自Abcam公司；索拉非尼由德國拜耳公司生產(chǎn)；根皮苷購自上海生命科學(xué)院。用CCK-8法確定50%細(xì)胞生長抑制(IC50)所須索拉非尼和根皮苷濃度，分別為5.01 μmol/L、4.98 μmol/L，均采用5 μmol/L。

1.2 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。索拉非尼組HepG2細(xì)胞給予索拉非尼5 μmol/L處理48 h；根皮苷組HepG2細(xì)胞給予根皮苷5 μmol/L處理48 h；索拉非尼聯(lián)合根皮苷組(聯(lián)合組)給予索拉非尼5 μmol/L+根皮苷5 μmol/L處理48 h。通過測定D450處光密度值，評估各組細(xì)胞活力。

1.3 細(xì)胞葡萄糖攝取 通過葡萄糖代謝比色試劑盒(Biovision公司)檢測HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取情況。各組HepG2細(xì)胞藥物處理48 h后，按照試劑盒說明書順次加入KRPH、葡萄糖攝取緩沖液、2DG，室溫避光孵育30 min后檢測熒光值。

1.4 細(xì)胞ATP檢測 采用ATP Detection Assay Kit(Abcam 公司)檢測細(xì)胞ATP。各組HepG2細(xì)胞藥物處理48 h后，按照說明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，順次加入ATP工作液。用分光光度計(jì)通過檢測光信號強(qiáng)弱，以此反映細(xì)胞內(nèi)ATP水平。

1.5 細(xì)胞caspase-3活力與凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測 采用 caspase-3 assay kit試劑盒(Abcam 公司)，通過比色法測定細(xì)胞caspase-3活力。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)通過Annexin Ⅴ/PI雙染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 索拉非尼和根皮苷對細(xì)胞活力的影響 CCK-8檢測結(jié)果(圖1)顯示：索拉非尼5 μmol/L處理48 h后，HepG2細(xì)胞活力降低(P<0.05)；根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細(xì)胞活力降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；聯(lián)合組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，與其他組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 索拉非尼和根皮苷對葡萄糖攝取的影響 細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示：索拉非尼5 μmol/L處理48 h后，HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取較對照組與較索拉非尼組均減少(P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞葡萄糖攝取進(jìn)一步減少，與其他組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組HepG2細(xì)胞活力檢測結(jié)果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

圖2 各組HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取檢測結(jié)果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

2.3 索拉非尼和根皮苷對細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響 細(xì)胞ATP檢測結(jié)果(圖3)顯示：與對照組相比，索拉非尼5 μmol/L與根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP生成均減少(P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)ATP進(jìn)一步減少，與其他組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組HepG2細(xì)胞ATP含量測定結(jié)果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

2.4 索拉非尼和根皮苷對細(xì)胞凋亡的影響 Caspase-3活力檢測結(jié)果(圖4)顯示：與對照組相比，索拉非尼5 μmol/L與根皮苷5 μmol/L處理48 h后，HepG2細(xì)胞內(nèi)caspase-3活力均提高(P<0.05)；聯(lián)合組caspase-3活力進(jìn)一步提高，與其他組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組HepG2細(xì)胞凋亡與caspase-3變化情況一致(圖5)。

圖4 各組HepG2細(xì)胞caspase-3 活力檢測結(jié)果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

圖5 各組HepG2細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

*P<0.05與對照組相比；△P<0.05與索拉非尼組相比；▲P<0.05與根皮苷組相比

3 討 論

索拉非尼主要通過抑制Raf激酶活性和血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、c-kit活性等，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖及新生血管生成[6]。通過該作用，索拉非尼可以延長晚期肝癌患者生存時(shí)間，但有效率較低。因此，迫切須要探索可能的調(diào)控靶分子，并與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)而提高索拉非尼的療效。

根皮苷可抑制多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體或通道[7]，從而減少細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量，抑制糖酵解，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞能量供給。本研究中，索拉非尼組與根皮苷組腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP含量均減少，與研究[8]結(jié)論一致；根皮苷組細(xì)胞葡萄糖攝取減少，根皮苷引起肝癌細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低可能與其抑制葡萄糖攝取有關(guān)；索拉非尼聯(lián)合根皮苷組腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取和細(xì)胞內(nèi)ATP含量較單藥組進(jìn)一步減少，這種腫瘤細(xì)胞能量代謝抑制效應(yīng)可能體現(xiàn)為細(xì)胞活力降低、凋亡增加。

本研究中，根皮苷組細(xì)胞活力與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陳娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低血糖能改善氧化損傷細(xì)胞的活力，維持細(xì)胞形態(tài)。根皮苷減少葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)而可能不抑制細(xì)胞的活力的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究中，索拉非尼可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相似；索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑時(shí)，這種促凋亡效應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)。這是因?yàn)樗骼悄峥梢越档湍[瘤細(xì)胞內(nèi)ATP含量，從而影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝，而與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制。此外，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與肝癌分期晚、分化差等因素相關(guān)[11-12]，而索拉非尼可通過降低缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)來下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)[13-14]。因此，聯(lián)合應(yīng)用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑時(shí)，索拉非尼療效增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)能量進(jìn)一步減少、細(xì)胞凋亡增加。

綜上所述，代謝抑制劑可以通過協(xié)同索拉非尼抑制腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取來減少細(xì)胞內(nèi)能量，進(jìn)而降低細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高索拉非尼的療效。本研究為晚期肝細(xì)胞癌患者索拉非尼的優(yōu)化治療，以及提高晚期肝癌患者生存率提供了新思路。