毛凱來(lái)， 李 兵

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200003

結(jié)節(jié)病是一種以非干酪性上皮樣肉芽腫為病理表現(xiàn)、全身多系統(tǒng)受累的疾病，以肺臟和胸部淋巴結(jié)受累最常見(jiàn)。結(jié)節(jié)病目前尚無(wú)根治性治療方法，糖皮質(zhì)激素仍是首選藥物，但長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可引起嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，有待研發(fā)新的治療結(jié)節(jié)病的藥物。

胸腺肽α1(Tα1)是由胸腺上皮細(xì)胞和胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的活性多肽。其作為免疫調(diào)節(jié)劑，已被廣泛用于病毒性肝炎、腫瘤、重癥感染等多種疾病的治療[1-3]。 研究[4]表明，結(jié)節(jié)病與1型T輔助細(xì)胞(Th1)免疫反應(yīng)明顯相關(guān)。本研究以分枝桿菌過(guò)氧化物歧化酶多肽A (superoxide dismutase A ,Sod A) 誘導(dǎo)肺結(jié)節(jié)病小鼠模型，給予其Tα1治療，通過(guò)病理學(xué)、T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)，初步探討Tα1對(duì)結(jié)節(jié)病小鼠的治療效果及可能的機(jī)制，為結(jié)節(jié)病的藥物治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及來(lái)源 選擇25只雌性、6～8周齡C57BL/6小鼠(購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量18～22 g， SPF級(jí)。注射用胸腺法新(日達(dá)仙)購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥房。Sod A(Gen Bank序列號(hào)： DQ768096)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司采用固相肽合成法合成，純度>90%(高效液相色譜法)。不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。小鼠CD3-per CP、CD4-FITC、CD8-Cy5.5、CD25-PE、Foxp3-FITC、IL-17-Cy5.5、IL-4 PE和IFN-γAPC抗體購(gòu)自美國(guó)Biolgend公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備 25只C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：模型組15只、空白對(duì)照組10只。第1天：模型組每只給予50 μg Sod A與IFA 0.25 mL混合液皮下注射；空白對(duì)照組給予0.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS) 皮下注射。第14天：模型組給予50 μg Sod A與6 000粒瓊脂糖珠(溶于0.5 mL PBS，Sod A與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián))尾靜脈注射；空白對(duì)照組給予PBS 0.5 mL尾靜脈注射。第22天：每組隨機(jī)取5只小鼠，用6%水合氯醛0.2 mL腹腔注射麻醉后，脫頸臼法處死。

1.3 Tα1干預(yù)治療 第22～35天：將模型組剩余的10只小鼠隨機(jī)分為2組，模型組5只、給藥組5只。給藥組每天給予10 μg Tα1腹腔注射；模型組、空白對(duì)照組每天給予0.5 mL PBS腹腔注射。第36天：小鼠經(jīng)6%水合氯醛0.2 mL腹腔注射后，用脫頸臼法處死。

1.4 一般情況及組織學(xué)觀察 每日觀察小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)、毛發(fā)等一般情況。在第22、36天處死、解剖小鼠后，觀察其肺臟及肺門淋巴結(jié)改變，用摘眼球法留取外周血。取出淋巴結(jié)及肺，4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(H-E)染色觀察。免疫組化檢測(cè)T細(xì)胞CD4+抗原和巨噬細(xì)胞標(biāo)志性抗原Mac-2表達(dá)。

1.5 外周血中T細(xì)胞亞群及CD4/CD8檢測(cè) 用摘眼球法取小鼠外周血，將外周血單核細(xì)胞(PBMC)從血液中分離出來(lái)，用佛波酯(PMA，50 ng/mL)、離子霉素(1 μg/mL)、BFA(3 μg/mL)和莫能菌素(1.4 μg/mL)刺激5 h，進(jìn)行染色標(biāo)記。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、Th1、Th2、CD4、CD8。

1.6 肺組織勻漿和血漿中白細(xì)胞介素10(IL-10)、IL-17A水平檢測(cè) 取小鼠相同部位的肺組織，剪碎，加入1 mL 0.9%氯化鈉液，在勻漿器中研磨，制成肺組織勻漿，1 500 r/min(r=225 mm)，離心10 min，取上清。采用多因子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)勻漿上清和血漿中的IL-17A、IL-10水平。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況及組織觀察 小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)死亡，進(jìn)食、毛發(fā)、活動(dòng)情況無(wú)顯著差別。造模完成后(第22天)：模型組小鼠肺門淋巴結(jié)腫大、質(zhì)稍硬、活動(dòng)度可、與周圍組織無(wú)粘連，肺有肉眼可見(jiàn)的顆粒樣改變；空白對(duì)照組小鼠無(wú)明顯淋巴結(jié)腫大，肺無(wú)明顯異常。給藥完成后(第36天)：給藥組小鼠肺門淋巴結(jié)腫大、質(zhì)稍硬、活動(dòng)度可、與周圍組織無(wú)粘連，肺稍許粗糙；模型組小鼠肺門淋巴結(jié)腫和肺表現(xiàn)與給藥組相似；空白對(duì)照組無(wú)明顯異常(圖1)。

圖1 開(kāi)始建模后第36天小鼠肺組織外觀

2.2 H-E染色結(jié)果 第22天：模型組小鼠肺組織H-E染色顯示，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，形成多個(gè)大小不等的以類上皮細(xì)胞為中心、淋巴細(xì)胞圍繞的非干酪性肉芽腫；空白對(duì)照組小鼠肺泡、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)淋巴細(xì)浸潤(rùn)及肉芽腫(圖2)，說(shuō)明模型成功建立。

圖2 開(kāi)始建模后第22天小鼠肺組織H-E染色結(jié)果

第36天：H-E染色顯示，模型組肺組織中可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及多個(gè)大小不等的肉芽腫；給藥組肺組織中可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽腫，但較模型組改善；空白對(duì)照組肺泡、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)淋巴細(xì)浸潤(rùn)及肉芽腫(圖3)。

圖3 開(kāi)始建模后第36天小鼠肺組織H-E染色結(jié)果

A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：給藥組. Original magnification: ×100

2.3 免疫組化結(jié)果 模型組小鼠肉芽腫中心巨噬細(xì)胞特異性抗原Mac-2表達(dá)陽(yáng)性、周圍CD4+T細(xì)胞陽(yáng)性(圖4)。

圖4 模型組小鼠肉芽腫中Mac-2表達(dá)及周圍CD4+T細(xì)胞分布情況

2.4 外周血中Th1、Th2、Th17、Treg及CD4/CD8水平 模型組及給藥組外周血中Th1、Th17百分比均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，Th2比例與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組間外周血中CD4/CD8及Treg比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

2.5 血漿和肺組織勻漿中細(xì)胞因子IL-10、IL-17A水平 模型組血漿IL-10水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)；給藥組與空白對(duì)照組、模型組血漿IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組血漿IL-17A濃度高于空白對(duì)照組(P<0.05)；給藥組與空白對(duì)照組、模型組血漿IL-17A水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組間肺組織IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組肺組織IL-17A水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)；給藥組與空白對(duì)照組、模型組肺組織IL-17A差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

圖5 外周血Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8比較

圖6 血漿和肺組織中細(xì)胞因子IL-17A、IL-10水平

3 討 論

結(jié)節(jié)病的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。一般認(rèn)為，結(jié)節(jié)病是在遺傳、環(huán)境、感染等因素的綜合影響下出現(xiàn)的以細(xì)胞免疫功能失調(diào)為主的免疫異常狀態(tài)。研究[5]表明，結(jié)節(jié)病與Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)。而Sod A從結(jié)節(jié)病患者病灶中分離而來(lái)，與患者Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)。Swaisgood等[6]用人工合成的SodA作為免疫原成功誘導(dǎo)建立了肺結(jié)節(jié)病肉芽腫小鼠模型。 這一模型的病理組織形態(tài)、免疫反應(yīng)特點(diǎn)與人類結(jié)節(jié)病肉芽腫類似。

Th17是CD4+T細(xì)胞一種亞型。IL-17是其重要效應(yīng)細(xì)胞。IL-17包含6個(gè)亞型(IL-17A～F)，其中以IL-17A的生物學(xué)作用最為突出[7]。Treg是具有免疫調(diào)節(jié)功能的一種CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，在維持免疫耐受、調(diào)節(jié)自身免疫中起重要作用[8]。研究認(rèn)為，結(jié)節(jié)病患者中，Th17分化增強(qiáng)[9-11]，而Treg的變化則不明確[9-13]。

本研究參考Swaisgood等[6]的方法，成功構(gòu)建了C57BL/6小鼠結(jié)節(jié)病肉芽腫模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組Th1增加，外周血Th17增加，血漿和肺組織勻漿中IL-17A水平升高，而外周血Treg比例和肺組織內(nèi)IL-10水平無(wú)明顯變化。本研究中Th17變化情況與研究[9-11]結(jié)果。有研究[12]認(rèn)為，結(jié)節(jié)病患者Treg增加，外周血及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中Treg比例升高；而Idali等[13]發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)病患者BALF中Treg細(xì)胞相關(guān)基因(FoxP3、IL-10、TGF-β)的表達(dá)下降。上述研究中Treg水平不一致的原因可能為：(1)一般以Foxp3為Treg的特異性標(biāo)志無(wú)，但有少部分Treg為Foxp3陰性，且Foxp3亦表達(dá)于CD8+T細(xì)胞；(2)結(jié)節(jié)病涉及的免疫反應(yīng)復(fù)雜，個(gè)體免疫狀態(tài)也有差別。

Tα1是在1966年由Goldstein在小牛胸腺中分離純化而來(lái)[14]。作為胸腺肽α家族的一員，其是由胸腺上皮細(xì)胞和胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的高度保守的活性肽，可通過(guò)多種機(jī)制作用于免疫系統(tǒng)。Tα1可以促進(jìn)T細(xì)胞的成熟，提高T細(xì)胞產(chǎn)生特定細(xì)胞因子的能力，增加Treg細(xì)胞比例[15]，已被廣泛用于多種疾病的治療，如腫瘤、重癥感染、病毒性肝炎等[1-3]。目前鮮見(jiàn)Tα1在結(jié)節(jié)病治療中應(yīng)用的報(bào)道。本研究對(duì)結(jié)節(jié)病模型小鼠進(jìn)行Tα1治療，發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠肺部病理改變較模型組小鼠改善，但兩組小鼠外周血Th17、Treg、IL-17A水平及肺組織IL-17A、IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究中小鼠數(shù)量較少、Tα1治療時(shí)間較短有關(guān)。其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制和藥物量效關(guān)系以及臨床藥物實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，C57BL/6結(jié)節(jié)病肉芽腫模型小鼠Th17增加。Tα1對(duì)結(jié)節(jié)病肉芽腫模型小鼠有一定的療效，其Tα1可能通過(guò)下調(diào)Th17水平達(dá)到治療效果，但因樣本量少等原因未得出有意義的結(jié)論，尚須加大樣本量進(jìn)一步研究。