， ，

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

作為世界上栽培面積最大，利用率最廣的豆科“牧草之王”：紫花苜蓿，其產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，是牧草育種者最為關(guān)注的焦點(diǎn)，而其獨(dú)特高蒸騰的生物學(xué)特性，是品種產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。孫東寶等[8]研究發(fā)現(xiàn)灌水能改變苜蓿葉片Pn的日變化格局，灌水較多的苜蓿葉片沒(méi)有出現(xiàn)光合“午休”現(xiàn)象，Pn的日變化趨勢(shì)呈現(xiàn)“單峰”型；羅永忠等[9]認(rèn)為苜蓿葉水勢(shì)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)均隨水分脅迫加劇而降低；干熱脅迫下苜蓿凈光合速率與蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、水分利用效率均成極顯著正相關(guān)而與胞間二氧化碳濃度成極顯著負(fù)相關(guān)[10]。佟長(zhǎng)福[11]研究了苜蓿的葉水勢(shì)、蒸騰速率在不同灌溉水平下的日變化規(guī)律與土壤含水率和氣象因素之間關(guān)系，建立了葉水勢(shì)和蒸騰速率與氣象因素間的定量關(guān)系式。本文擬對(duì)滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗的氣孔運(yùn)動(dòng)與光合生理變化進(jìn)行研究，旨在揭示紫花苜蓿水分脅迫與光合生理以及生長(zhǎng)的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果可為深入研究紫花苜蓿抵抗?jié)B透脅迫的機(jī)制及苜蓿高產(chǎn)育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿品種維多利亞(MedicagoSativa‘victorian’)，購(gòu)自楊凌金道種子公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1幼苗培養(yǎng) 本試驗(yàn)于2015年3月在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)科學(xué)院草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選整齊一致完整的紫花苜蓿種子，用5% NaClO對(duì)種子消毒，浸泡30 min同時(shí)每隔10 min攪拌一次，最后用蒸餾水沖洗3～4次洗凈，并用吸水紙吸干種子殘留水分。在121℃下對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行高壓滅菌，持續(xù)40 min。將消毒種子均勻地?cái)[在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，于25±1℃，1 500 lx(12 h·d-1)的光培養(yǎng)箱中萌發(fā)。待兩片子葉完全展開(kāi)時(shí)選擇健康、生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行移栽，1/4MS營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。幼苗第三片真葉完全展開(kāi)時(shí)對(duì)幼苗進(jìn)行處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理分別是：CK(對(duì)照)：1/4MS營(yíng)養(yǎng)液；TM(脅迫)：1/4MS營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG-6000。

1.2.2光合特性指標(biāo)與幼苗測(cè)定 處理后第3 d、5 d、7 d，幼苗株高、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)用根系掃描儀掃描植株，再利用win RHNZOR分析軟件進(jìn)行測(cè)定，每處理測(cè)定5株，取均值；凈光合速率(Pn，μmol CO2·m-2·s-1)、蒸騰速率(Tr，mmol H2O·m-2·s-1)、氣孔導(dǎo)度(Gs，cm氣s-1)及胞間CO2濃度(Ci，μmol·mol-1)等用CI-340型手持式輕便型光合測(cè)定系統(tǒng)在自然光條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理測(cè)5株，取均值。葉片瞬時(shí)水分利用效率：WUE(μmol CO2·mmol-1)=Pn/Tr[12]， 光能利用效率：LUE(mmol CO2·mol-1) = Pn/PAR[13]。

1.2.3葉片氣孔指標(biāo)測(cè)定 光合測(cè)定后，取葉片置于4%戊二醛溶液中，4℃冷藏，經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水，丙酮置換浸透，臨界點(diǎn)干燥，粘臺(tái)噴金后，在JSM-6360 LI掃描電鏡下觀察葉片表皮氣孔形態(tài)特征，選取典型視野照相。統(tǒng)計(jì)單位視野內(nèi)的氣孔數(shù)目，計(jì)算氣孔密度；測(cè)量氣孔(保衛(wèi)細(xì)胞)的長(zhǎng)度(縱軸長(zhǎng))和寬度(橫軸長(zhǎng))與開(kāi)度的長(zhǎng)度和寬度，5次重復(fù)，每片葉隨機(jī)觀察10個(gè)視野。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2007進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)表示means±SD，采用DPS軟件對(duì)平均數(shù)以Duncan’s 新復(fù)級(jí)差法進(jìn)行多重比較。差異顯著記為P<0.05，差異極顯著記為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)變化

15% PEG滲透脅迫下，第5、7天TM株高比CK減少了10.8%和22.3%(P<0.05)，第7天CK株高比第3、5天增加了24.8%、19.5%(P<0.05)，第7天TM株高僅變化了5.3%；苜蓿幼苗根系生長(zhǎng)也發(fā)生顯著變化，第5、7天TM根長(zhǎng)比CK分別減少了5.7%和4.0%(P<0.05)(圖1-A,B,D,E,F)，比地上生長(zhǎng)受抑制程度明顯要小。脅迫初期(第3、5天)對(duì)幼苗側(cè)根數(shù)影響不大，但第7天TM幼苗側(cè)根數(shù)比CK減少了34.9%(P<0.05)(圖1-C,D,E，F(xiàn))；第7天CK側(cè)根數(shù)比第3天增加了152%，而TM增加了146%。滲透脅迫會(huì)抑制苜蓿幼苗側(cè)根數(shù)的增加，隨著滲透脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿幼苗的側(cè)根數(shù)都有所增加，但是TM側(cè)根數(shù)增加的比較少。滲透脅迫影響了苜蓿幼苗生長(zhǎng)及根系發(fā)育，尤其地上生長(zhǎng)顯著受抑制。

圖1 滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of osmotic stress on seedling growth of Alfalfa注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同字母者差異顯著(P<0.05)(下同)Note：The different letters in the same column mean significant differences at the 0.05 level, the same as below

2.2 滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿氣孔運(yùn)動(dòng)的影響

2.2.1滲透脅迫對(duì)氣孔密度和氣孔大小的影響 由圖2,3-A可知，15%PEG脅迫的第3天，TM氣孔密度與CK尚無(wú)顯著差異，處理后第5天TM與CK存在顯著差異，降低了22%(P<0.05)，第7天時(shí)則降低了55%(P<0.05)；15% PEG脅迫顯著影響苜蓿著幼苗氣孔寬度，第3，5，7天TM比CK分別減少了32%，18%，12%(P<0.05)(圖2,3-C)，但對(duì)苜蓿葉片氣孔長(zhǎng)度影響較小，僅在第7天TM比CK降低了46.9%(P<0.05)(圖2,3-B)。這說(shuō)明：15%PEG脅迫處理對(duì)紫花苜蓿葉片氣孔長(zhǎng)度造成的影響不大，卻導(dǎo)致紫花苜蓿葉片的氣孔寬度及密度發(fā)生顯著變化。

圖2 滲透脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片氣孔觀察Fig.2 Observation of stomatal movement in Alfalfa seedling leaves under osmotic stress

2.2.2滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿氣孔開(kāi)度大小的影響 由圖3D可知，15%PEG脅迫的第3天，TM和CK的氣孔開(kāi)度長(zhǎng)存在顯著差異，降低了18%(P<0.05)；脅迫時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，TM和CK無(wú)顯著差異(5，7天)。由圖3E可知，15%PEG脅迫的第3，5，7天，TM和CK的氣孔開(kāi)度寬均存在顯著差異，分別降低了38%、82%和56%(P<0.05)，那么，當(dāng)外部水分不足時(shí)，紫花苜蓿的氣孔開(kāi)寬度降低，通過(guò)氣孔逐漸閉合的方式來(lái)降低蒸騰作用，從而達(dá)到生物節(jié)水的目的。

圖3 滲透脅迫下紫花苜蓿氣孔的變化Fig.3 The effect of osmotic stress on the stomatal density and stomatal size of the Alfalfa seedling

2.3 滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗光合作用的影響

2.3.1凈光合速率變化 由圖4A可看出，15%PEG脅迫第3、5、7天，TM與CK相比，紫花苜蓿葉片凈光和速率(Pn)顯著下降(P<0.05)，分別減少了33.7%、44.9%、31.9%；第7天與第3天相比，TM和CK的凈光合速率分別增加了19.7%、16.2%。滲透脅迫顯著抑制植物的光合作用，降低其光合速率，處理的第5天植物光合下降最多，隨后植物可能經(jīng)過(guò)自身的調(diào)節(jié)出現(xiàn)升高趨勢(shì)。

圖4 滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗光合、蒸騰速率和水分利用率的影響Fig.4 The effect of osmotic stress on photosynthetic characteristics, transpiration and water use efficiency of Alfalfa.

由圖4B可看出，15%PEG脅迫的第3天，TM的光能利用率與CK無(wú)顯著差異，第5、7天有顯著差異(P<0.05)，第7天TM比CK減少了33.3%，TM和CK第7天的光能利用率比第3天增加了255%，445%。滲透脅迫使紫花苜蓿幼苗葉片光能利用效率顯著降低(P<0.05)。

2.3.2滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿蒸騰的影響 由圖4C可知，15%PEG脅迫的第3，5，7天，TM的蒸騰速率(Tr) 比CK分別下降了34%，36%和37%(P<0.05)；第3天TM與CK葉片瞬時(shí)水分利用率無(wú)顯著差異，第5，7天時(shí)TM與CK存在顯著差異，分別下降了35%和30%(P<0.05)(圖4D)。隨著水分不足的加深，植物則不斷進(jìn)行自我蒸騰能力的調(diào)節(jié)，來(lái)維持生命活動(dòng)基本水分要求，降低水分不足對(duì)細(xì)胞和組織的傷害。

2.4 滲透脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)與光合之間的關(guān)系

相關(guān)分析表明(表1)：滲透脅迫下，紫花苜蓿葉片Tr與根長(zhǎng)、株高、側(cè)根數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；根長(zhǎng)與Ci、株高呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；株高與Pn呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與Tr、Gs呈極顯著負(fù)相關(guān)或負(fù)相關(guān)(P<0.01或P<0.05)；側(cè)根數(shù)與Ci、株高呈極顯著正相關(guān)或顯著正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)，與Tr呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表1 滲透脅迫下生長(zhǎng)與光合相關(guān)系數(shù)表Table 1 The effect of osmotic stress on photosynthetic characteristics and Seedling growth of Alfalfa.

注：上標(biāo)*和 ** 分別表示在0.05水平和0.01水平上的差異顯著性

Note：* and ** indicate the significant difference at the 0.05 level and 0.01 level, respectively

3 討論與結(jié)論

植物葉表皮上氣孔是植物與外界水、氣交換的主要通道，直接控制蒸騰強(qiáng)度。葉水勢(shì)為-4.68 MPa或Tr為3.27 g·m-2·h-1時(shí)，苜蓿氣孔開(kāi)始關(guān)閉[14]，嚴(yán)重干旱時(shí)苜蓿氣孔關(guān)閉來(lái)限制水分的散失[15]，觀察了12個(gè)抗旱性不同苜蓿品種的葉表皮特征，李波等[16]認(rèn)為氣孔開(kāi)度和密度與苜蓿品種抗旱性強(qiáng)弱相關(guān)。隨著脅迫(15% PEG)強(qiáng)度加大，本試驗(yàn)中苜蓿幼苗氣孔密度逐漸減少，氣孔的大小及開(kāi)度隨脅迫時(shí)間也逐漸減?。稽S瓜(Cucumissativus)[17]為了延緩干旱脅迫，其幼苗葉片氣孔密度及開(kāi)度變小，大多數(shù)呈現(xiàn)關(guān)閉狀態(tài)，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，即苜蓿氣孔數(shù)目，大小和開(kāi)度大小與蒸騰強(qiáng)度密切相關(guān)。15% PEG處理下苜蓿氣孔密度減少、氣孔開(kāi)度大小的降低，減緩了蒸騰作用提高了苜蓿水分利用率，葉片凈光合速率和蒸騰速率決定著水分利用率，反映出植物對(duì)逆境適應(yīng)能力的強(qiáng)弱，那么，干旱下氣孔密度及開(kāi)度變化就可衡量苜蓿蒸騰強(qiáng)度及其抗旱強(qiáng)弱。

光合作用是植物體最重要的生理生化過(guò)程，直接關(guān)系著植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量及其抗逆性。干旱脅迫致使玉米(Zeamays)氣孔關(guān)閉引起蒸騰及光合下降，是玉米減產(chǎn)的主要生理機(jī)制[18]；抗旱性強(qiáng)的紫花苜蓿PSⅡ反應(yīng)中心電子傳遞活性受到的影響小，凈光合速率下降較慢[19]，光合強(qiáng)弱顯著關(guān)聯(lián)著植物生長(zhǎng)及其抗逆性。滲透脅迫最先影響植物的根系[20-21]，根系體積和根長(zhǎng)密度會(huì)因土壤干旱而顯著增加[22]；根系吸水阻力增加引起氣孔關(guān)閉及蒸騰減少，是水分匱乏下苜蓿幼葉凈光合速率下降主要原因[23]。干旱脅迫下紫花苜蓿的主根長(zhǎng)受到顯著抑制[3]，苜蓿根系會(huì)縱向伸長(zhǎng)[24]，在15% PEG模擬水分脅迫下，苜蓿幼苗側(cè)根數(shù)與Ci呈極顯著正相關(guān)(r=0.820)，則干旱下苜蓿主根受抑制而側(cè)根變發(fā)達(dá)，極有可能是由氣孔關(guān)閉后CO2濃度的升高引起。作物根系茂密會(huì)消耗大量光合同化物，造成水分利用效率降低[25]，15% PEG滲透脅迫下苜蓿側(cè)根數(shù)的增加不能促進(jìn)光合作用，表明干旱時(shí)側(cè)根增加只利于苜蓿抗旱卻對(duì)苜蓿產(chǎn)量貢獻(xiàn)不大；本試驗(yàn)中與苜蓿產(chǎn)量相關(guān)的根長(zhǎng)、株高均與蒸騰速率呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.910，r=-0.980)，凈光合速率與蒸騰速率也呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.690)，所以當(dāng)苜蓿遭遇水分脅迫時(shí)，通過(guò)氣孔關(guān)閉或密度減少促使蒸騰下降，確保其體內(nèi)有足夠的光合有效水分，以此保證水分匱乏時(shí)的光合能力，這有可能是旱作下苜?？购涤衷霎a(chǎn)的一個(gè)有效途徑。