， *， ， ，

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 湖北 武漢430064)

白三葉(Trifoliumrepens)是豆科三葉草屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，在我國(guó)引進(jìn)和栽培歷史較長(zhǎng)，是南方重要的栽培牧草[1]，適宜生長(zhǎng)于pH值5.5～6.5土壤，酸性土壤易遭受鋁毒害的影響[2]。白三葉較羅頓豆(Lotononisbainesii)、圓葉決明(Chamaecristarotundifolia)、大翼豆(Macroptiliumatropurpureum)等南方暖季型常見(jiàn)豆科牧草耐酸鋁性差[2]，但不同品種之間存在差異。且白三葉耐酸鋁特性屬隱性遺傳，酸鋁敏感特性更容易通過(guò)雜交遺傳給下一代[3]。因此白三葉種質(zhì)資源的耐酸鋁性評(píng)價(jià)對(duì)于育種材料選擇尤為重要。

Voigt等[4]于1994年發(fā)明一種在瓊脂上覆蓋一層薄的酸鋁毒土進(jìn)行生根的方法(Soil-on-Agar Method)用于白三葉酸鋁耐性評(píng)價(jià)，在該基質(zhì)上生根快的白三葉較生根慢的白三葉更耐酸鋁，而且該方法也可適用于其他小種子作物。國(guó)外對(duì)白三葉耐酸鋁鑒定主要采用苗期實(shí)驗(yàn)室鑒定，以根系生長(zhǎng)情況作為主要鑒定指標(biāo)[3-6]。國(guó)內(nèi)最早進(jìn)行耐酸鋁鑒定的作物是大麥(Hordeumvulgare)[7]，之后大豆(Glycinemax)[8]、圭亞那柱花草(Stylosanthesguianensis)[9]、小麥(Triticumaestivum)[10]、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)[11]、鴨茅(Dactylisglomerata)[12]、玉米(Zeamays)[13]、芝麻(Sesamumindicum)[14]、油菜(Brassicanapus)[15]等多個(gè)科屬的植物陸續(xù)進(jìn)行了耐酸鋁性的篩選；但針對(duì)白三葉耐酸鋁性的報(bào)道較少。作為我國(guó)南方當(dāng)家豆科牧草，開(kāi)展白三葉耐酸鋁種質(zhì)資源評(píng)價(jià)研究，對(duì)充分利用南方酸性紅壤區(qū)荒山荒地發(fā)展人工草地具有十分重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)來(lái)源于俄羅斯的57份種質(zhì)資源和9份國(guó)內(nèi)外育成品種進(jìn)行萌發(fā)期酸鋁耐性綜合評(píng)價(jià)，旨在篩選耐酸鋁性強(qiáng)的材料，為白三葉種質(zhì)資源耐酸鋁特性研究奠定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

66份白三葉種子材料由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供，57份來(lái)源于俄羅斯，9份是國(guó)內(nèi)外育成品種(表1)。

表1 66份白三葉種質(zhì)資源基本信息Table 1 The basic information of 66 white clover resources

1.2 試驗(yàn)方法

選取大小均勻一致、飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的種子，用50%多菌靈可濕性粉劑500倍液浸泡種子20 min，蒸餾水洗凈待用。以6H2O·AlCl3配制Al3+濃度2 mmol·L-1，pH 4.5的溶液來(lái)模擬酸鋁脅迫條件，對(duì)照組(CK)為去離子水。采用發(fā)芽盒濾紙法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每處理4次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。每發(fā)芽盒分別加入15 ml相應(yīng)處理溶液，于人工氣候箱進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(20℃，16 h光照/ 8 h黑暗)，試驗(yàn)過(guò)程中不再加入任何溶液，第10 d結(jié)束試驗(yàn)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

每隔24 h記錄種子發(fā)芽數(shù)(以胚根或胚芽突破種皮長(zhǎng)于種子長(zhǎng)度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，并計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)(試驗(yàn)第4 d數(shù)據(jù))、發(fā)芽率(試驗(yàn)第10 d數(shù)據(jù))、發(fā)芽指數(shù)[11]和活力指數(shù)(發(fā)芽指數(shù) × 根長(zhǎng))。

第10 d每處理隨機(jī)選取10株幼苗，清水洗凈后用LA-S系列植物根系分析系統(tǒng)軟件(杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司)掃描分析幼苗胚根長(zhǎng)(mm)、胚長(zhǎng)(mm)、胚根長(zhǎng)/苗長(zhǎng)、胚根表面積(mm2)，胚根體積(mm3)，胚根平均直徑(mm)等性狀指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Excel 2010進(jìn)行整理計(jì)算，用DPS 7.05和SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

為減少材料間指標(biāo)性狀固有差異，試驗(yàn)各指標(biāo)值均使用相對(duì)值。指標(biāo)相對(duì)值(%)= 指標(biāo)脅迫處理值 / 指標(biāo)對(duì)照處理值 × 100。

以相關(guān)性分析和因子主成分分析方法進(jìn)行耐酸鋁評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選；用加權(quán)隸屬函數(shù)法(以變異系數(shù)賦予權(quán)重)計(jì)算綜合隸屬函數(shù)值(D值)對(duì)參試材料的耐酸鋁強(qiáng)弱排序；用系統(tǒng)聚類(lèi)法對(duì)66份材料進(jìn)行耐酸鋁性強(qiáng)弱聚類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸鋁脅迫對(duì)白三葉種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響

66份白三葉材料萌發(fā)期各項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(表2)可知：與對(duì)照組相比，酸鋁脅迫組參試材料的各項(xiàng)指標(biāo)均值變化除胚長(zhǎng)和胚根平均直徑為正值外，其余變化值都為負(fù)值。白三葉的活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)/苗長(zhǎng)和胚根表面積等受抑制作用明顯，變異系數(shù)變化值均在14%以上。

表2 酸鋁脅迫下66份白三葉材料10項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)的變化情況Table 2 Variation of 10 indexes value in 66 white clover materials under acid-aluminum stress

2.2 觀測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)10項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)值進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析(表3)：白三葉的萌發(fā)和根系生長(zhǎng)兩類(lèi)指標(biāo)間分別存在極顯著或顯著相關(guān)性(P<0.01或P<0.05)；其中，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)，兩兩間存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)；相對(duì)活力指數(shù)與其它胚根指標(biāo)均存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)。

表3 酸鋁脅迫下66份白三葉材料各指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficients of indexes in 66 materials under acid-aluminum stress

注：**表示極顯著相關(guān)性(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)性(P<0.05)

Note: **indicates significant at the 0.01 level. *indicates significant at the 0.05 level

2.3 耐酸鋁評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

對(duì)10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行因子主成分分析(表4)發(fā)現(xiàn)：前三個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到83.182 %，且特征值均大于1。結(jié)合因子載荷矩陣(表5)，確定第一主成分為胚根生長(zhǎng)因子，對(duì)應(yīng)特征向量中載荷較大的5個(gè)指標(biāo)是相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)胚根長(zhǎng)、相對(duì)胚根表面積、相對(duì)胚根長(zhǎng)/苗長(zhǎng)和相對(duì)胚根體積；第二主成分為萌發(fā)特性因子，對(duì)應(yīng)特征向量中載荷較大的3個(gè)指標(biāo)為相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)；第三主成分反映植株形態(tài)特征，定名為株型因子，特征向量載荷較大的2個(gè)指標(biāo)為相對(duì)胚根平均直徑和相對(duì)苗長(zhǎng)。

綜合指標(biāo)相關(guān)性分析和因子主成分分析結(jié)果，在第一主成分胚根生長(zhǎng)因子中選擇與其他指標(biāo)存在極顯著相關(guān)性且特征值最大的指標(biāo)是相對(duì)活力指數(shù)，第二主成分萌發(fā)特性因子中選擇與其他根系指標(biāo)存在極顯著相關(guān)性且特征值最大的指標(biāo)是相對(duì)發(fā)芽勢(shì)，第三主成分株型因子中選擇與其他指標(biāo)極顯著相關(guān)且特征值最大的指標(biāo)是相對(duì)胚根平均直徑。以上3項(xiàng)指標(biāo)作為白三葉萌發(fā)期耐酸鋁性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，用于對(duì)66份白三葉材料進(jìn)行耐酸鋁性綜合隸屬函數(shù)值的計(jì)算。

表4 三個(gè)主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率Table 4 Special values and contributions of 3 principal components

表5 各因子載荷矩陣Table 5 Loading matrix of each component

2.4 66份白三葉材料萌發(fā)期耐酸鋁綜合評(píng)價(jià)

因篩選出的3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均為正向指標(biāo)，所以用正向隸屬函數(shù)公式計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。根據(jù)變異系數(shù)賦權(quán)公式計(jì)算出3項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重值，用綜合隸屬函數(shù)公式計(jì)算66份白三葉材料的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值(D值)。表6中綜合隸屬函數(shù)值結(jié)果可看出：66份白三葉材料的耐酸鋁能力存在明顯差異，排在前三位的編號(hào)為66號(hào)、17號(hào)、8號(hào)的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值分別為0.890、0.745、0.675，表明這些材料在66份材料中的耐酸鋁性較強(qiáng)；排在最后兩位隸屬函數(shù)值分別是0.128(1號(hào))和0.106(39號(hào))，表明這些材料耐酸鋁能力弱。

表6 66份白三葉材料耐酸鋁隸屬函數(shù)值Table 6 Subordinate function value of 66 white clover materials’ acid-aluminum tolerance

續(xù)表6

2.5 耐酸鋁性能聚類(lèi)

將66份白三葉材料的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值用歐氏距離平均連鎖法進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖1)，在歐氏距離15處將參試材料分為3個(gè)類(lèi)群：第1類(lèi)群包括編號(hào)為66、17、8、14、21、57號(hào)，占所有白三葉材料的9%，該類(lèi)群耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值高，表明耐酸鋁能力較強(qiáng)。第2類(lèi)群包括編號(hào)為7、30、22、52號(hào)等58個(gè)種質(zhì)材料，占所有材料的88%，該類(lèi)群耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值在66份材料中排名居中，表明這些材料的耐酸鋁能力居中。第3類(lèi)群包括編號(hào)為39號(hào)和1號(hào)，占所有白三葉材料的3%，該類(lèi)群的耐酸鋁綜合隸屬函數(shù)值最低，表明這兩個(gè)材料耐酸鋁性最差。由圖2可知，3類(lèi)不同耐酸鋁級(jí)別的代表性材料在植株根系生長(zhǎng)狀況差異明顯，耐酸鋁性強(qiáng)的材料植株胚根生長(zhǎng)更健康，而酸鋁脅迫敏感材料則表現(xiàn)出明顯的根部損傷。

圖1 66份白三葉材料耐酸鋁性聚類(lèi)Fig.1 Dendrogram on acid-aluminum tolerance of 66 white clover materials

圖2 不同耐酸鋁水平代表材料的植株形態(tài)對(duì)比Fig.2 Comparison of representative materials’ appearance with different acid-aluminum tolerance

3 討論

3.1 耐酸鋁篩選指標(biāo)的確定

隨著氮肥的大量施用、酸雨、不良耕作方式等現(xiàn)象的加劇，我國(guó)的土壤酸性問(wèn)題愈加嚴(yán)重，而鋁毒害是酸性土壤的突出問(wèn)題，篩選耐酸鋁毒害的作物品種是解決酸性土壤地區(qū)生產(chǎn)最為便捷的途徑[16]。鋁對(duì)植物的毒害首先表現(xiàn)在抑制植物根系的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響?zhàn)B分和水分的吸收，因而根系生長(zhǎng)相關(guān)的指標(biāo)往往是作物鋁毒耐性篩選時(shí)主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]。林咸永等[10]和李學(xué)文等[18]認(rèn)為相對(duì)根長(zhǎng)或根相對(duì)伸長(zhǎng)率是小麥或豌豆耐酸鋁性較為理想的篩選指標(biāo)。除應(yīng)用單一根系指標(biāo)外，還有些使用根系及地上部的多個(gè)指標(biāo)作為酸鋁的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，如應(yīng)小芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)大豆相對(duì)根系干重、相對(duì)地上部干重、相對(duì)株高、相對(duì)葉面積與所有農(nóng)藝、生理指標(biāo)進(jìn)行的秩和比排序獲得的綜合評(píng)價(jià)系數(shù)呈極顯著相關(guān)，可作為大豆耐鋁毒基因型篩選的有效指標(biāo)。唐新蓮等[13]以根尖相對(duì)伸長(zhǎng)率、根尖胼胝質(zhì)和鋁含量和根尖染色作為玉米耐鋁性的綜合篩選指標(biāo)；孫建等[14]以相對(duì)成苗率，相對(duì)芽長(zhǎng)，相對(duì)根長(zhǎng)，相對(duì)苗鮮重作為芝麻的評(píng)價(jià)指標(biāo)；褚曉晴等[19]利用相對(duì)根系干重、相對(duì)地上部分干重、相對(duì)全株干重對(duì)假儉草的雜交后代的耐酸鋁性評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)通過(guò)主成分分析和相關(guān)性分析確定相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)胚根平均直徑作為白三葉苗期耐酸鋁評(píng)價(jià)指標(biāo)。由此可見(jiàn)，不同作物對(duì)酸鋁脅迫反應(yīng)有所區(qū)別，不同品種間農(nóng)藝形狀或生理指標(biāo)的變異系數(shù)各不一致，但總體來(lái)看，根系性狀是重要的參數(shù)，本試驗(yàn)中首次提出相對(duì)平均直徑作為白三葉的篩選指標(biāo)。

3.2 耐酸鋁篩選統(tǒng)計(jì)方法的選擇

植物的抗逆性是多種因素相互作用構(gòu)成的較為復(fù)雜的綜合性狀，多種因素或性狀在反映植物抗逆性本質(zhì)時(shí)存在一定的相關(guān)關(guān)系和主次關(guān)系。因此，對(duì)植物抗逆性的評(píng)價(jià)應(yīng)有系統(tǒng)科學(xué)的評(píng)價(jià)方法。模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法或者歐氏距離聚類(lèi)分析法經(jīng)常被用于評(píng)價(jià)植物抗逆性[11，14]，它能對(duì)多項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可有效避免單一指標(biāo)評(píng)價(jià)的片面性。但它會(huì)忽略多項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)間存在的相關(guān)關(guān)系和主次關(guān)系。在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，指標(biāo)相關(guān)性分析和主成分分析能客觀地分析指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系和主次關(guān)系；變異系數(shù)賦權(quán)法能較好地區(qū)分指標(biāo)重要性差異。因此，本研究結(jié)合以上方法，先篩選抗逆評(píng)價(jià)指標(biāo)，然后對(duì)指標(biāo)進(jìn)行賦權(quán)，最后計(jì)算加權(quán)隸屬函數(shù)值對(duì)植物抗逆性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。這種通過(guò)多指標(biāo)、去重復(fù)、算權(quán)重的方法，既能全面反映植物抗逆性信息，又能客觀區(qū)分指標(biāo)重要性差異，是一套適用于評(píng)價(jià)植物抗逆性的科學(xué)系統(tǒng)的分析方法，可廣泛應(yīng)用于植物抗逆性鑒定和篩選的研究工作。

4 結(jié)論

酸鋁脅迫對(duì)白三葉種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)造成不利影響，幼苗根的伸長(zhǎng)會(huì)受到抑制，根長(zhǎng)與苗長(zhǎng)比值、胚根表面積、胚根體積等根系指標(biāo)受抑制作用明顯，根直徑增加，但不同材料間存在顯著差異，耐酸鋁性強(qiáng)的材料較不耐酸鋁材料受抑制影響小。

根據(jù)指標(biāo)相關(guān)性分析和因子主成分分析篩選出相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)胚根平均直徑等3項(xiàng)酸鋁脅迫耐性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

耐酸鋁性較強(qiáng)的材料有：‘海發(fā)’， ‘ZXY06P-1927’，‘ZXY06P-1768’，’ZXY06P-1879’，‘ZXY06P-2029’，‘ZXY06P-2659’；其中‘海發(fā)’在我國(guó)南方已有較大范圍的種植區(qū)域，其余5個(gè)材料是來(lái)源于俄羅斯的種質(zhì)資源，未來(lái)可對(duì)這些材料進(jìn)一步研究，為耐酸鋁白三葉遺傳育種和種植推廣提供科學(xué)支持。