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(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山西 太谷 030801； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院， 北京 100193； 3. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所， 山西 大同 037008)

玉米青貯具有產(chǎn)量高、消化率高、能量高以及易調(diào)制和適口性好等優(yōu)勢，在牛、羊等反芻動物粗飼料供應(yīng)中占有舉足輕重的地位。適宜的水分含量是青貯飼料保存的重要條件之一，青貯原料含水量要求在65%～70%范圍內(nèi)[1]。青貯飼料發(fā)酵中適宜的水分含量能影響細(xì)菌總數(shù)和發(fā)酵速率[2]。原料中的含水量是保證青貯過程中乳酸菌新陳代謝的條件之一，過高或過低的水分含量都會影響飼料發(fā)酵過程和青貯飼料的品質(zhì)。如果水分含量過高， 青貯發(fā)酵過程中養(yǎng)分損失多，梭菌繁殖會造成飼料腐敗難以得到控制，影響青貯品質(zhì)[3]。含水量過低，原料裝填時(shí)難以壓緊，原料間會殘留大量的空氣，青貯料汁液濃度越大，導(dǎo)致滲透壓較強(qiáng)，抑制了青貯飼料的發(fā)酵，酵母和霉菌易于生長，易引起“二次發(fā)酵”的現(xiàn)象[4]。本研究將玉米(ZeamaysL.)原料晾干后，施以滅菌處理，再設(shè)置不同的含水量，評估滅菌處理對不同含水量青貯玉米的影響，一方面探討原料水分對青貯玉米發(fā)酵的影響，同時(shí)旨在為將來評定青貯添加劑的直接效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

青貯滅菌處理，青貯過程中，優(yōu)質(zhì)青貯隨發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物數(shù)量呈先增后減的趨勢，初期養(yǎng)分充足且有一定的含氧量，無論是真菌還是細(xì)菌均快速增殖，后期隨著可利用營養(yǎng)物減少，氧氣的消耗和一些產(chǎn)酸菌的產(chǎn)物導(dǎo)致PH降低，能存活的微生物也隨之減少。在青貯前對原料進(jìn)行滅菌處理，可排除微生物對于研究水分時(shí)的影響。滅菌處理也可減少青貯本身營養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高利用率和經(jīng)濟(jì)效益。本文研究了對原料滅菌條件下青貯的發(fā)酵情況，并與通常的青貯發(fā)酵模式比較優(yōu)劣。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料為全株青貯玉米，品種為晉單42號，取自山西省晉中市太谷縣昌晟農(nóng)牧專業(yè)合作社(37°25′ N，112°23′ E，海拔799 m)，將蠟熟期全株玉米收割后(無泥土)取回，進(jìn)行機(jī)器切割，切碎長度1～2 cm，在室內(nèi)陰干，通風(fēng)且避免陽光照射，含水量間隔3 h測一次，在陰干15 h時(shí)水分含量為77%，48 h含水量55%，64 h含水量為40%，86 h含水量為25%。取目的含水量原料混合均勻，每罐裝入140 g樣品，壓實(shí)，瓶口覆膜密封。青貯容器選用容積為500 ml的玻璃罐(直徑8.5 cm，高10 cm，壁厚0.2 cm)。滅菌處理組將裝滿原料的青貯罐用高壓滅菌鍋在121℃條件下滅菌30 min，冷卻后備用。將制作好的青貯罐，置于17～37℃的室內(nèi)貯藏(避免陽光直射)。青貯前全株玉米營養(yǎng)成分見表1，包括干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、粗脂肪(ehanol extract，EE)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、粗灰分(Ash)與淀粉(Starch)。

表1 青貯前全株玉米營養(yǎng)成分Table 1 The nutrition components in whole-plant corn before ensiling

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)包括滅菌和水分處理2個(gè)因素，滅菌設(shè)滅菌與不滅菌2個(gè)處理，水分梯度分別為25%，40%，55%和70%的含水量，共形成8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The experimental design

注：NM組為不滅菌處理，1～4水分含量從低到高分別為25%，40%，55%，70%，SM組為滅菌處理，1～4水分含量從低到高分別為25%，40%，55%，70%

Note: The NM group was not sterilized. The moisture content from 1～4 was from low to high, 25%, 40%, 55%, and 70%, respectively. The SM group was sterilized, and the 1～4 water content was from low to high, respectively 25 %, 40%, 55%, 70%

1.3 取樣分析

每次取樣時(shí)，開罐后首先除去上層1 cm厚的青貯料，充分混勻，測定青貯的pH、有機(jī)酸和氨態(tài)氮(NH3-N)。同時(shí)測定DM、EE、Ash、CP、NDF、ADF、WSC、Starch，乳酸菌、酵母菌和霉菌，有氧穩(wěn)定性，水活度。精密酸度計(jì)(PHS-2C)測定pH[5]，高效液相色譜法測定有機(jī)酸[6]，苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N[7]。烘干法測定DM[8]。索氏抽提法測定EE[9]。凱氏定氮法測定CP[10]。按照Association of official Analytical Chemists (AOAC) 2002的方法測定Ash[11]。范氏(Van Soest)洗滌纖維濾袋法測定NDF和ADF[12]。蒽酮-硫酸法測定WSC[13]。Herrera-Saldana等方法測定Starch[14]，用水分活度儀(HD-4)測定水活度(Aw)。

取鮮樣10 g，裝入盛有0.85%滅菌生理鹽水225 ml的三角瓶內(nèi)，置于搖床上震蕩30 min， 稀釋100倍后取100 μl于MRS培養(yǎng)基上，涂布均勻，在30℃下培養(yǎng)48 h[15]。霉菌和酵母菌用孟加拉紅培養(yǎng)基，30℃條件下培養(yǎng)48 h對活菌進(jìn)行有效計(jì)數(shù)[16]。

對有氧穩(wěn)定性進(jìn)行評定，在發(fā)酵42 d后打開全部青貯罐取樣，每個(gè)處理取50 g，充分混勻，松散放入500 ml玻璃罐。每個(gè)罐口覆蓋兩層粗棉布，以避免污染和防止樣品水分散失，樣本保存在室溫下(19～25℃)。測量溫度時(shí)，數(shù)字溫度計(jì)探頭放在青貯飼料的中間。有氧穩(wěn)定性測量當(dāng)青貯飼料溫度超過環(huán)境溫度2℃時(shí)說明青貯開始腐敗變質(zhì)，記錄時(shí)間[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測定數(shù)據(jù)用 Excel 2007 及SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌處理對不同含水量玉米青貯營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，不同水分含量對營養(yǎng)成分也表現(xiàn)出一定的影響，高水分滅菌組干物質(zhì)保存率達(dá)到99.40%，而不滅菌組的干物質(zhì)的保存率為97.67%，不滅菌組的可溶性碳水化合物為4.15%，而滅菌組可溶性碳水化合物高達(dá)18.10%。 試驗(yàn)結(jié)果表明，青貯前后各處理之間，營養(yǎng)成分除干物質(zhì)含量有差異之外，CP，EE，Ash，NDF，ADF，Starch 含量差異不顯著。WSC 含量相對于青貯前，不滅菌組含量損失較大，而其它組變化不大。

2.2 滅菌對不同含水量玉米青貯發(fā)酵有機(jī)酸的影響

由表4可知，通過對各處理組青貯飼料的檢測，從全株玉米青貯過程中的 pH 變化看 ，不滅菌組的pH相比滅菌組較低，高水分含量玉米青貯比低水分組玉米青貯pH 低，乳酸(lactic acid，LA)含量高水分組低于低水分組，滅菌組在高溫滅菌條件下沒有乳酸產(chǎn)生。高水分處理組的乙酸(acetic acid，AA)含量和丙酸(propionic acid，PA)含量都始終低于低水分組。滅菌組因處于高溫滅菌條件，乙酸和丙酸均未檢測到。此外，在本試驗(yàn)中，未檢測到有丁酸的存在，表明青貯飼料保存比較成功。不同含水量處理間玉米青貯料的氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)含量有所不同，高水分組的氨態(tài)氮含量最高。

表3 玉米青貯飼料的營養(yǎng)成分Table 3 Nutritional Components of Corn Silage

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同小寫字母表示不同處理間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，下同

Note: Different small letter in the same column means significantly differences among different treatment at the 0.05 level, the same as below

表4 玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)pH和有機(jī)酸Table 4 The pH and organic acids content of Corn silage

注： -表示沒有檢測到含量

Note: - indicates that no content was detected

2.3 滅菌對不同含水量玉米青貯飼料微生物的影響

青貯玉米飼料中微生物數(shù)量分析見表5所示。在高溫滅菌條件下，無乳酸菌和霉菌產(chǎn)生。不滅菌條件下NM3和NM4乳酸菌含量無差異，NM1組含量低于NM2組(圖1A)，不滅菌處理下4個(gè)梯度的含水量酵母菌含量基本無差異，開始增長緩慢，后趨于穩(wěn)定(圖1B)，霉菌含量在0～3天時(shí)迅速增長，之后減少，不同含水量青貯霉菌含量NM1>NM2>NM3>NM4(圖1C)。高含水量組NM4乳酸菌含量為3.45，0～3 d急速增長，第7 d時(shí)達(dá)到高峰6.99，之后趨于穩(wěn)定，酵母菌和霉菌0～3 d時(shí)也在增長，但增長曲線幅度沒有乳酸菌急劇，酵母菌在第7 d時(shí)與乳酸菌含量接近，之后緩慢下降；而霉菌的含量顯著低于乳酸菌和酵母菌，在第7 d達(dá)到峰值5.13，之后迅速下降，霉菌在青貯完成時(shí)僅以極少量的狀態(tài)存在(圖1D)。

表5 玉米青貯飼料中的微生物Table 5 Microorganisms in Corn Silage/log cfu·g-1 FM

注： log cfu·g-1FM為每g青貯中菌落的對數(shù)值，下同

Note: Log cfu·g-1FM is the logarithm of colonies per g of silage, the same as below

圖1 不滅菌處理不同含水量乳酸菌(A)、酵母菌(B)和霉菌(C)的動態(tài)變化Fig.1 Non-sterile treatment of different moisture Dynamic changes of lactic acid bacteria (A), yeast (B) and mold (C)

2.4 滅菌對不同含水量玉米青貯飼料水活度的影響

從表6可以看出，青貯玉米發(fā)酵中，高水分玉米Aw略高于低水分玉米，滅菌組與不滅菌組差異不顯著。

2.5 滅菌對不同含水量玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響

2.5.1玉米青貯有氧暴露溫度變化 在發(fā)酵42 d后打開青貯罐取樣分析，結(jié)果如圖2所示，滅菌組青貯溫度達(dá)到高于環(huán)境溫度2℃的時(shí)間明顯高于不滅菌組，不滅菌組分別40 h，50 h，50 h，60 h后高出外界環(huán)境溫度2℃，而滅菌組分別在70 h，80 h，80 h，90 h后出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)。

表6 青貯玉米飼料的水活度Table 6 The water activity of corn silage

圖2 青貯飼料暴露于空氣下的有氧穩(wěn)定性Fig.2 Aerobic stability of silage exposed to air

2.5.2玉米青貯有氧暴露后營養(yǎng)成分變化 從表7可以看出Ash和Starch比有氧暴露前有所增加，其他指標(biāo)略有下降。WSC損失較大，不滅菌NM4組為4.05%，是青貯前的3.4倍。

表7 不同含水量的青貯玉米營養(yǎng)成分(%DM)的影響Table 7 The influence of different water content of corn silage nutrition ingredient

2.5.3不同含水量在有氧暴露情況下對pH、有機(jī)酸的影響 青貯玉米在整個(gè)有氧暴露過程中，暴露后pH升高，高水分組pH明顯低于低水分組，而滅菌組pH變化不大。乳酸含量整體呈下降，而乙酸和丙酸隨著暴露在空氣中高于暴露前，滅菌組暴露后沒有檢測到乳酸、乙酸、丙酸和氨態(tài)氮含量(見表8)。

表8 玉米青貯有氧暴露pH和有機(jī)酸的變化情況Table 8 The pH and organic acids dynamic in aerobic expose changes of the corn silage

2.5.4玉米青貯有氧暴露后微生物變化 從表9可知，青貯玉米在空氣中有氧暴露，滅菌70%含水量組乳酸菌數(shù)量相比暴露前(6.87 log cfu·g-1FM)下降顯著，酵母菌數(shù)量增長緩慢。與暴露前相比，霉菌數(shù)增多，出現(xiàn)有霉變，霉味。滅菌處理組乳酸菌含量為0，酵母菌和霉菌數(shù)量大幅增加，酵母數(shù)量SM4組比NM4組增長約1.2倍，霉菌數(shù)量SM4組達(dá)到7.37 log cfu·g-1FM，SM4組比NM4組增漲1.7倍。

表9 玉米青貯有氧暴露微生物數(shù)量變化Table 9 Microbial quantity changes of the corn silage aerobic expose/log cfu·g-1 FM

3 討論

3.1 不同含水量對玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

不同的水分含量對營養(yǎng)成分也表現(xiàn)出一定的影響，適中的水分處理營養(yǎng)成分略高于低含水量和高含水量。試驗(yàn)結(jié)果表明，青貯前后，各處理組營養(yǎng)成分中除DM含量有差異外，CP，EE，NDF，ADF與Ash含量的平均值均表現(xiàn)出差異不顯著，而WSC含量相對于青貯前，不滅菌組含量損失較大，這與金加明和范華[18]的報(bào)道一致。在試驗(yàn)中WSC作為發(fā)酵底物適當(dāng)增長被認(rèn)為是至關(guān)重要的[19]，WSC含量低，發(fā)酵不充分，pH不能迅速下降，發(fā)酵品質(zhì)從而降低。適當(dāng)降低青貯原料的含水量可使WSC等養(yǎng)分濃縮，有利于乳酸菌發(fā)酵，提高青貯品質(zhì)[20]。而且水分含量為70%WSC含量適當(dāng)，有利于乳酸菌發(fā)酵[21]。滅菌組的WSC含量高達(dá)18% DM，可能的原因是滅菌處理殺死了絕大多數(shù)的微生物，原本微生物消耗的那部分營養(yǎng)物質(zhì)以碳水化合物的形式保留，而沒有轉(zhuǎn)化為相關(guān)的有益產(chǎn)物，類似于乳酸和蛋白酶等。這種情況存在隱患，即當(dāng)有害微生物(如：霉菌和酵母菌)的入侵或者青貯開罐有氧暴露后有害菌感染的發(fā)生，因沒有與其競爭性的菌產(chǎn)生抑制作用，從而對青貯的營養(yǎng)品質(zhì)造成極大的損失。NH3-N含量是評價(jià)青貯品質(zhì)好壞的重要依據(jù)，NH3-N含量越高說明營養(yǎng)物質(zhì)分解越多，青貯料的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值就越低。NH3-N/%TN更能反應(yīng)出飼料中蛋白質(zhì)的降解情況，可以較好的表達(dá)青貯品質(zhì)的好壞，NH3-N/%TN變化幅度越小，青貯飼料的有氧穩(wěn)定性越好，反之越差。高水分組青貯和低水分組青貯NH3-N/%TN值均低于5%，但70%含水量的青貯比25%含水量的青貯NH3-N/%TN變化幅度小。本試驗(yàn)NDF和ADF含量對比原料有下降的趨勢，這與席興軍[22]在玉米秸中添加乳酸菌結(jié)果相一致。

3.2 不同含水量及滅菌處理對玉米青貯微生物的影響

本試驗(yàn)分析了不同含水量梯度下微生物的種類和數(shù)量差異。在青貯飼料發(fā)酵過程中，因青貯含水量不同，發(fā)酵期間青貯飼料中存在的微生物也有差別，但主要存在的有益微生物是乳酸菌，屬兼性厭氧型微生物，在無氧條件下也生長良好，其主要特征是以糖為發(fā)酵底物產(chǎn)生乳酸，乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物乳酸是導(dǎo)致青貯飼料酸度升高的主要原因之一，且能對不耐酸的有害厭氧微生物產(chǎn)生抑制作用。故青貯飼料的優(yōu)劣與否取決于乳酸菌的作用，因此，反映青貯質(zhì)量的重要指標(biāo)即乳酸的生成量，也是影響pH最主要的因素之一。

在青貯發(fā)酵初期，玉米附著的好氧細(xì)菌、酵母及霉菌等利用體系殘留的氧氣消耗原料中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖[23]。隨著在密閉環(huán)境中時(shí)間延長，各微生物的發(fā)酵活動致使氧氣快速消耗，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸使pH下降。氧氣的減少和pH的降低改變了霉菌的生長環(huán)境，霉菌數(shù)量顯著減少，整體呈現(xiàn)先緩慢上升后迅速下降的趨勢，在青貯完成時(shí)僅以極少量的狀態(tài)存在。而低pH和無氧的環(huán)境有利于乳酸菌的生長繁殖，乳酸含量增多，酸性環(huán)境增強(qiáng)，使乳酸菌含量整體呈現(xiàn)先顯著升高，達(dá)到最大值后稍微下降最后趨于穩(wěn)定的生長狀態(tài)。其次，微生物的生長需要一定的水分維持，本研究中高水分條件下青貯玉米的微生物含量與低水分條件下青貯玉米微生物含量相比也存在差異。在發(fā)酵42 d時(shí)，含水量為25%條件下青貯玉米乳酸菌的含量為3.72 log cfu·g-1FM，含水量為70%條件下青貯玉米乳酸菌含量為6.87 log cfu·g-1FM，差異顯著。最后，在有氧暴露過程中，隨氧氣的大面積接觸，一些好氧腐敗菌開始滋生。酵母菌和霉菌數(shù)量均有升高，出現(xiàn)霉變。

不同的微生物之間，最適、最高和最低的水分活度也不同。酵母菌的最低Aw值范圍在0.94～0.88，霉菌的最低Aw值范圍在0.94～0.73。低水分條件下，滲透壓高，細(xì)胞原生質(zhì)濃縮發(fā)生質(zhì)壁分離，故降低水活度不利于微生物生長。減少水分中的溶解氧，可抑制好氧微生物生長。本試驗(yàn)青貯玉米發(fā)酵中，高水分玉米青貯水活度值高于低水分玉米青貯，滅菌組與不滅菌組差異不顯著。在微生物的生長中，水活度、溫度和pH之間存在一定的協(xié)同作用[24]。青貯飼料中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物可降低pH，酸度增加，好氧微生物的耐滲透力顯著下降，抑制霉菌和酵母菌的生長，從而有利于青貯的健康發(fā)酵。

在高溫滅菌條件下，高水分組和低水分組均沒有產(chǎn)生有益菌和腐敗菌，表明滅菌處理可以抑制所有微生物的繁殖。

3.3 不同含水量及滅菌處理對玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響

在有氧暴露條件下，無論是滅菌組還是不滅菌組，含水量為70%條件下的青貯玉米DM，CP，EE較含水量為25%條件下的青貯玉米高，但差異不顯著。有氧暴露后，Ash和Starch比有氧暴露前有所增加，WSC損失較大，高水分組損失率小于低水分組的青貯玉米，但差異不顯著。滅菌組分別在70 h，80 h，80 h，90 h后青貯溫度比周圍環(huán)境溫度高2℃，說明滅菌處理可以有效延長有氧穩(wěn)定的時(shí)間。

當(dāng)青貯玉米在空氣中有氧暴露，不滅菌組與暴露前相比，無論是高水分還是低水分，乳酸菌的數(shù)量均有下降趨勢，但NM4組較NM1組乳酸菌含量高，有研究表明，添加乳酸菌可以保持青貯的有氧穩(wěn)定[25]，滅菌組乳酸菌含量均未檢測到。不滅菌組酵母菌和霉菌含量低，滅菌組酵母菌和霉菌含量顯著增加，酵母數(shù)量SM4組是NM4組的1.2倍，霉菌數(shù)量SM4組是NM4組的1.7倍。原因有可能是，受外界酵母菌和霉菌感染，而青貯本身經(jīng)滅菌后微生物含量極少，更加缺乏可抑制有害菌的微生物，再加之可利用的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，故繁殖速度增快，加速青貯腐敗，導(dǎo)致青貯品質(zhì)大大降低。這一假設(shè)與有氧暴露后青貯的WSC顯著減少相符合，但進(jìn)一步的數(shù)據(jù)論證滅菌處理導(dǎo)致青貯WSC含量虛高還有待后續(xù)試驗(yàn)。

4 結(jié)論

不同含水量的青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)差異較大，高水分青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)較低水分青貯玉米優(yōu)良。滅菌處理可以抑制所有微生物的繁殖。不滅菌組含水量在70%條件下，玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)最佳。