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(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京100193; 3. 包頭市家畜改良工作站, 內(nèi)蒙 古包頭014000)

我國鹽漬土面積約為3.46×107hm2[1]，鹽害嚴(yán)重影響了植物的生長發(fā)育，成為農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要問題。研究表明，挖掘植物自身的耐鹽堿能力，是有效改良、利用鹽堿地的途徑之一[2-4]。植物在鹽脅迫下具有不同的形態(tài)表現(xiàn)，其萌發(fā)特性以及分子機(jī)制都會發(fā)生一定的改變，可用于分析不同植物的抗性強(qiáng)弱[5]。

百脈根(Lotuscorniculatus)是多年生豆科植物，具有營養(yǎng)含量豐富、粗蛋白含量高、適口性好、飼用價值高、保水功能強(qiáng)等特點(diǎn)，是飼喂家禽、家畜的優(yōu)良牧草[6]，其植株匍匐生長，覆蓋度好，具發(fā)達(dá)根系，細(xì)胞再生性好，自交親和，易得到穩(wěn)定遺傳后代[7-8]，在改良草場和建立人工草地中得到了廣泛的應(yīng)用，但其大部分品種的耐鹽性較差，鹽堿地上種植較難獲得大量的生物量[9]，因此篩選耐鹽性強(qiáng)的百脈根材料應(yīng)從抗性較強(qiáng)的野生材料入手，通過鑒定其耐鹽性，將其應(yīng)用到高產(chǎn)、耐鹽堿的新品種培育中，對鹽堿地改良具有重要意義。

本試驗以2個百脈根品系為材料，用不同濃度梯度NaCl溶液模擬鹽脅迫，測定其萌發(fā)特性，通過方差分析、相關(guān)分析、主成分分析、加權(quán)隸屬函數(shù)等方法，研究百脈根對鹽脅迫的響應(yīng)以及綜合評價其耐鹽性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的2個百脈根品系為B1和B2，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所國家牧草資源圃課題組提供，其中B1于2009年引種自加拿大，經(jīng)過多年的篩選，現(xiàn)已適于呼和浩特地區(qū)的種植，B2為2014年采集于加拿大圭爾夫的野生品系。

1.2 試驗方法

種子萌發(fā)試驗采用紙上發(fā)芽法，發(fā)芽盒(10 cm×10 cm×6 cm)中鋪兩層濾紙作為發(fā)芽床，挑選飽滿均勻的百脈根種子50粒，砂紙打磨后置于發(fā)芽盒中，在發(fā)芽盒中分別注入濃度為0.3%，0.6%，0.9%，1.2%的NaCl溶液5 ml，以蒸餾水為對照(CK)[10-11]，每處理重復(fù)3次。將發(fā)芽盒置于E/PGC系列進(jìn)入式植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗，相對濕度為60%、恒溫25℃條件下連續(xù)培養(yǎng)11 d，逐日定時稱重并補(bǔ)充水分，每日記錄種子發(fā)芽數(shù)，并于第11 d測量種子的胚芽長、胚根長，然后將幼苗置于通風(fēng)處自然風(fēng)干，30 d后稱量幼苗干重。

1.3 測定指標(biāo)與方法

萌發(fā)期測定種子發(fā)芽勢(germination energy,GE)、發(fā)芽率(germination rate,GR)、根長(root length,RL)、幼苗長(seeling length,SL)和幼苗干重(dry weight,DW)，并計算種子發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)和活力指數(shù)(vigor index, VI)。計算方法參照文獻(xiàn)[12]，公式如下：

GR= n/N×100%，其中n為11 d 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子數(shù)；

GE= n/N×100%，其中n為前5 d發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子數(shù)；

GI=ΣGn/Dn，其中Gn為第n d種子發(fā)芽的個數(shù)，Dn為發(fā)芽天數(shù)；

VI= GI × S，其中S為幼苗重量/g。

1.4 綜合評價方法

綜合評價百脈根耐鹽性的方法參照文獻(xiàn)[7,12]。

各測定指標(biāo)進(jìn)行鹽害系數(shù)計算：STC = M/C×100%，其中STC為鹽害系數(shù)，M為各處理測定值，C為對照測定值。

隸屬函數(shù)值計算方法：Xi= (Xi-Xmin)/ (Xmax-Xmin) i = 1,2,...,n ，其中Xi表示第i個綜合指標(biāo)；Xmin表示i個綜合指標(biāo)中的最小值；Xmax表示i個綜合指標(biāo)中的最大值。

各綜合指標(biāo)的權(quán)重計算：

各品種綜合耐鹽能力的評價：

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007對數(shù)據(jù)統(tǒng)計及初步分析并作圖，SAS 9.0對各測試指標(biāo)進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析和主成分分析，加權(quán)隸屬函數(shù)法對2個百脈根品系耐鹽性進(jìn)行綜合評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)特性

由表1中可以看出，隨著鹽濃度的升高，品系B1的GR、GE、GI、RL、SL5項指標(biāo)出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，VI呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，DW呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢；品系B2的GI呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，GE、VI、DW 3項指標(biāo)呈現(xiàn)下降后升高再下降的趨勢，GR、RL、SL 3項指標(biāo)出現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。大部分鹽濃度脅迫下，品系B1和B2的的萌發(fā)特性存在差異，其中在對照組品系B2的GR和GE兩項指標(biāo)顯著高于品系B1(P<0.05)；在0.3%和0.6%處理組，品系B1和B2之間的差異未達(dá)到顯著水平；在0.9%處理組品系B2的VI、RL、SL均顯著高于B1(P<0.05)；在1.2%處理組，除VI和SL外，品系B2的其它5項指標(biāo)均顯著高于B1(P<0.05)，且品系B1的各項指標(biāo)均為0，表明其在該濃度下喪失萌發(fā)能力，但品系B2的種子依然具有一定的萌發(fā)能力。

由于B1、B2這2個品系對照之間的各指標(biāo)值不同，在模擬鹽脅迫時，不同鹽濃度下各指標(biāo)值的變化與該材料自身的萌發(fā)特性有直接關(guān)系，無法直接判斷2個品系的耐鹽性強(qiáng)弱。因此，將其轉(zhuǎn)化成鹽害系數(shù)比較，并進(jìn)行方差分析(圖1)。結(jié)果表明，鹽濃度為0.3%時，B1和B2間的差異未達(dá)到顯著水平；鹽濃度為0.6%時，B2的VR和DW的鹽害系數(shù)顯著高于B1(P<0.05)；鹽濃度為0.9%時，B2的VI、RL、SL和DW的鹽害系數(shù)均顯著高于B1(P<0.05)；鹽濃度為1.2%時，B2所有供試指標(biāo)鹽害系數(shù)均顯著高于B1(P<0.05)。

表1 不同鹽濃度下百脈根材料各指標(biāo)值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 1 Germination characteristics of the Lotus corniculatus strains under Different salt concentration (mean±standard deviation)

注：不同字母表示不同材料之間差異顯著(P<0.05)

Note：Values with different letters in the same column for each germination characteristic show significant differences among different strains at the 0.05 level

2.2 萌發(fā)指標(biāo)的相關(guān)分析

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果(表2)，各萌發(fā)指標(biāo)之間均存在不同程度的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.474～0.974之間，其中GR和GE，GR和GI，GE和GI，GE和SL，GI和RL、SL以及RL和SL之間呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，其他指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系未達(dá)到顯著水平。在對2個品系的耐鹽性評價時，不同指標(biāo)所攜帶的信息部分重合，并且其在百脈根耐鹽性中起到作用大小有差異，因此單項指標(biāo)無法科學(xué)、準(zhǔn)確的評價百脈根的耐鹽性，為彌補(bǔ)單項指標(biāo)的不足，需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用其他統(tǒng)計分析方法分析。

圖1 鹽脅迫下百脈根種子萌發(fā)特性鹽害系數(shù)的方差分析Fig.1 Variance analysis of salt damage coefficient of seed germination characteristics of Lotus corniculatus under salt stress注：不同小寫字母表示相同鹽濃度不同指標(biāo)間差異顯著(P<0.05)Note：Values with different little letters show significant differences among different indexes in the same salt concentration at the 0.05 level

2.3 萌發(fā)指標(biāo)的主成分分析

對百脈根種子萌發(fā)測定的7個單項指標(biāo)進(jìn)行了主成分分析(表3)，結(jié)果表明，第1主成分F1的貢獻(xiàn)率為47.38%，第2、3主成分F2、F3的貢獻(xiàn)率分別為40.57%和8.71%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到96.65%，7個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個綜合指標(biāo)(F1、F2、F3)，保留了原有的絕大部分信息。

表2 各指標(biāo)相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of each index

注：*和**分別表示在0.05水平下和0.01水平下顯著相關(guān)

Note: * and ** indicate that significant differences at the 0.05 and the 0.01 level

表3 萌發(fā)期各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 3 the germination of the composite index of the coefficient and contribution rate

2.4 百脈根種子萌發(fā)期耐鹽性綜合評價

根據(jù)隸屬函數(shù)公式計算2個百脈根品系萌發(fā)期各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Xi(表4)，鹽脅迫下，對于同一綜合指標(biāo)而言，如F1，其隸屬函數(shù)值Xi較大的是B2，值為1.000，則該品系在F1表現(xiàn)出的耐鹽性較強(qiáng)；而B1的Xi值較小(值為0)，表明該材料在這一綜合指標(biāo)下耐鹽性差，由此可見，3個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值中，B1均小于B2。根據(jù)各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率，得到百脈根萌發(fā)期3個綜合指標(biāo)的權(quán)重(W)分別為0.474、0.406和0.087以及耐鹽評價值D值，并根據(jù)D值的大小對百脈根材料進(jìn)行耐鹽能力的綜合排序(表4)，其中B1和B2的D值分別為0.000和0.967，表明B2耐鹽性強(qiáng)于B1。

表4 萌發(fā)期各綜合指標(biāo)值(Fi)、權(quán)重、隸屬函數(shù)值(Xi)、D值及綜合排序Table 4 The comprehensive index value (Fi), weight, membership function value (Xi), D value and comprehensive ranking

3 討論

自然界中植物的耐鹽性是由其種類決定的，并且相同個體不同發(fā)育時期其耐鹽性也不同，種子萌發(fā)期植物對鹽脅迫較敏感，易受到土壤中鹽的毒害，生長緩慢甚至致死，有研究表明植物種子萌發(fā)期耐鹽性可用于鑒定其耐鹽性強(qiáng)弱[13]。土壤中的有害鹽類以NaCl等中性鹽為主，并且以Na+和Cl-對植物的危害最為嚴(yán)重[14-16]，因此本試驗采用不同濃度NaCl溶液對2個百脈根品系進(jìn)行種子萌發(fā)期的耐鹽性研究。

由于鹽脅迫對百脈根種子萌發(fā)期的影響涉及到離子毒害、礦質(zhì)元素虧缺等綜合反應(yīng)，因此，其耐鹽性成為多因子影響的復(fù)雜性狀，單一的使用某個指標(biāo)難以準(zhǔn)確的反應(yīng)百脈根耐鹽性的強(qiáng)弱[17-18]?，F(xiàn)階段國內(nèi)外學(xué)者在研究植物種子萌發(fā)期耐鹽性中，篩選出了與植物耐鹽性相關(guān)的形態(tài)和生理等指標(biāo)[19-20]，本試驗中選取了簡單、直觀的7項指標(biāo)進(jìn)行了測定，并結(jié)合多元統(tǒng)計方法對百脈根種子萌發(fā)期進(jìn)行了耐鹽性的綜合評價。

圖1中的方差分析結(jié)果表明，部分測試指標(biāo)(GR、GE、GI、RL、SL)值隨著鹽濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其它供試指標(biāo)均呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，這與張俊葉[13]的研究結(jié)果基本一致。本試驗中，出現(xiàn)上升的各指標(biāo)值均處于較低鹽濃度(0.3%和0.6%)處理，表明低濃度的鹽溶液處理促進(jìn)種子萌發(fā)，與汪永平等[21]的研究結(jié)果基本一致。這可能是由于在低濃度鹽溶液中，無機(jī)鹽小分子解離為對應(yīng)的離子，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)水勢降低，從而增加了種子的吸水量，進(jìn)而提高發(fā)芽率以及促進(jìn)了幼苗生長[22-23]。隨著鹽濃度繼續(xù)升高，2個百脈根品系萌發(fā)期的各指標(biāo)值均開始下降，表明高濃度的鹽脅迫會影響其種子萌發(fā)甚至致死，這與譚化等[24]在百脈根試管苗的耐鹽性研究結(jié)果基本一致，這可能是由于鹽濃度的升高，植物根部滲透勢變化較大，外部滲透勢高導(dǎo)致植物根部吸水能力下降，進(jìn)而缺水死亡。相關(guān)分析的結(jié)果顯示，各指標(biāo)之間存在顯著、極顯著正相關(guān)，若用此直接進(jìn)行隸屬函數(shù)法評價可能會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。主成分分析可以在損失較少信息量的前提下，將較多的測定指標(biāo)轉(zhuǎn)化成少量的綜合指標(biāo)，彌補(bǔ)用單項指標(biāo)評價耐鹽性的不足[25]，將7個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)換成了3個相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，進(jìn)而得到綜合評價值(D值)，客觀的反應(yīng)了2個百脈根品系的耐鹽性[15]，為后期的耐鹽育種提供理論依據(jù)。由于幼苗期的耐鹽性也是反映該品系的耐鹽情況的重要標(biāo)準(zhǔn)，因此，有必要進(jìn)一步對幼苗期耐鹽性進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本試驗中的2個百脈根品系在不同鹽濃度下耐鹽性強(qiáng)弱表現(xiàn)不同，隨著鹽濃度的增加兩個百脈根品系的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，活力指數(shù)呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，3個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值中，B1均小于B2?？傊?，來源于加拿大圭爾夫的野生百脈根品系(B2)的耐鹽性強(qiáng)于加拿大引進(jìn)品系(B1)。