劉 丹,靳 寧,楊 婷,奧瑞芳,喬 華

(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,太原 030001;2出生缺陷與細胞再生山西省重點實驗室;3山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心;*通訊作者,E-mail:danliu007@126.com)

雙十二烷基二甲基溴化銨(didodecyldimethylammonium bromide,DDAB)是第一個被合成的,具有兩條飽和氫鏈的陽離子表面活性劑[1,2],可以自發(fā)形成水分散相和固態(tài)支持相以模擬生物膜結(jié)構(gòu)[3-5],常被用于陽離子脂質(zhì)體傳遞工具以改善藥物的傳遞效能[6-9],然而單獨使用DDAB常會使DNA變性、多種細胞凋亡,對機體存在潛在的毒副作用[10,11]。

載藥脂質(zhì)體在到達靶器官發(fā)揮作用之前,會和血液中蛋白質(zhì)發(fā)生作用。免疫球蛋白是血液中含量最豐富的免疫蛋白,參與外源性物質(zhì)在體內(nèi)的運送、分布、代謝及消除等過程,是一種重要的潛在藥物運輸?shù)鞍?對研究藥物循環(huán)和藥物對人體的影響有重要意義[12]。

本研究以免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)為研究對象,采用熒光猝滅法研究DDAB與IgG的結(jié)合作用,計算出結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、結(jié)合熱力學(xué)參數(shù),并用同步熒光光譜、圓二色譜考察了IgG在DDAB作用下構(gòu)象的變化,為闡明DDAB在陽離子脂質(zhì)體中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DDAB(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),用蒸餾水配制1.0×10-4mol/L儲備液,常溫保存;IgG(購自SIGMA-ALDRICH),用pH=7.40磷酸鹽緩沖溶液(簡稱PBS溶液)配制1.5×10-5mol/L儲備液,保存于4 ℃冰箱中備用;其他試劑均為分析純;實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器設(shè)備

Cary Eclipse熒光光譜儀(美國Varian公司);UV 2550紫外分光光度計(日本Shimadzu公司);MOS 500圓二色光譜儀(法國Bio-Logic公司);pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠);Milli-Q Academic A10(美國Milli-Q公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 儲備液配制 IgG儲備液配制:用pH=7.40磷酸鹽緩沖溶液(簡稱PBS溶液)配制1.5×10-5mol/L IgG儲備液,保存于4 ℃冰箱中備用。

DDAB儲備液配制:用蒸餾水配制1.0×10-4mol/L儲備液,常溫保存。

1.3.1.2 DDAB-IgG混合液配制 在10 ml比色管中,依次加入1.0 ml IgG儲備液及不同體積DDAB儲備液,再加入適量PBS溶液,配制成DDAB濃度梯度為0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,20.0 μmol/L的DDAB-IgG混合液。

1.3.2 光譜測定

1.3.2.1 紫外光譜 在恒溫25 ℃儀器室中,Shimadzu UV 2550紫外分光光度計記錄200-300 nm范圍內(nèi)298.15 K時各樣品的紫外吸收光譜,其中石英比色皿厚度為1.0 cm。

1.3.2.2 熒光光譜 Cary Eclipse熒光光譜儀的光源為氙弧燈,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm,在預(yù)先設(shè)定的溫度下,利用熒光光譜儀“Prescan”功能選擇待測溶液的最佳激發(fā)光波長,以IgG的最佳激發(fā)光波長280 nm為激發(fā)光源,記錄300-400 nm波長范圍熒光發(fā)射光譜,熒光比色皿厚度為1.0 cm。

1.3.2.3 同步熒光光譜 同步熒光光譜測定條件:激發(fā)光和發(fā)射光波長差(Δλ)分別固定在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm,其他條件同1.3.2.2。

1.3.2.4 圓二色譜 室溫下,利用MOS 500圓二色光譜儀測定各樣品在200-250 nm波長范圍的圓二色譜,比色皿厚度為1.0 cm,掃描速度60 nm/min。

2 結(jié)果

2.1 紫外吸收光譜

圖1A反映DDAB對IgG紫外吸收光譜的影響,如圖所示,IgG的紫外吸收光譜中有兩個吸收峰,220 nm附近的強吸收峰是蛋白質(zhì)中肽鍵結(jié)構(gòu)的典型特征吸收峰,由肽鍵中的-C=O的π→π*躍遷引起[13],吸收峰的摩爾吸收系數(shù)較大;270-283 nm范圍(280 nm附近)出現(xiàn)的弱吸收峰是色氨酸、酪氨酸等殘基的特征吸收峰,因此,可利用弱吸收峰的變化來反映IgG中氨基酸環(huán)境的變化。DDAB在200-300 nm范圍內(nèi)無特征吸收峰。當DDAB與IgG的濃度比在1 ∶1到20 ∶1范圍時,IgG 220 nm處強吸收峰峰值下降,出現(xiàn)減色效應(yīng),表明二者混合時DDAB對IgG的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。圖1B反映不同濃度的DDAB對IgG紫外吸收光譜的影響趨勢,如圖所示,根據(jù)280 nm吸收峰摩爾吸收系數(shù)較小且由280 nm藍移到278 nm的特點,判斷弱吸收為n→π*躍遷產(chǎn)生。

2.2 DDAB對IgG的猝滅機制研究

2.2.1 DDAB與IgG作用的熒光猝滅光譜 DDAB與IgG作用的熒光光譜圖見圖2。

由圖2可以看出,隨著DDAB的濃度增大,IgG的熒光強度逐漸降低,熒光峰發(fā)生弱的紅移,由333 nm紅移到335 nm,說明DDAB會引起IgG的熒光猝滅。其原因是IgG分子的多肽鏈發(fā)生一定程度的伸展,包埋在蛋白分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來,使得熒光基團的疏水性降低,氨基酸殘基的微環(huán)境極性增大,暗示著IgG的構(gòu)象發(fā)生改變,這與圓二色譜實驗相符。

a: IgG濃度為1.5 μmol/L; b: IgG濃度為1.5 μmol/L,DDAB濃度為10 μmol/L; c: DDAB濃度為10 μmol/LA.DDAB與IgG相互作用的紫外吸收光譜曲線1-10: IgG濃度為1.5 μmol/L, DDAB濃度分別為0, 2.0, 4.0,6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 20.0 μmol/L； T=298.15 KB.不同濃度DDAB對IgG紫外吸收光譜的影響趨勢圖1 DDAB與IgG相互作用的紫外吸收光譜圖Figure 1 UV spectrum of IgG upon addition of DDAB

IgG濃度為1.5 μmol/L;曲線1-10：DDAB濃度分別為0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 20.0 μmol/L; T=298.15 K圖2 DDAB對IgG熒光光譜的影響Figure 2 Effect of DDAB on fluorescence spectra of IgG

2.2.2 DDAB對IgG的熒光猝滅機制 為了進一步闡明DDAB對IgG的熒光猝滅機理,用Stern-Volmer方程(1)[14]對測定數(shù)據(jù)進行分析:

(1)

式中，F(xiàn)0和F分別是未加入和加入DDAB時IgG的熒光強度;KSV為動態(tài)猝滅常數(shù);[Q]為DDAB的濃度;Kq為雙分子猝滅速率常數(shù);τ0為猝滅體不存在時熒光分子平均壽命。

作出F0/F-[Q]關(guān)系圖并計算出不同溫度下的動態(tài)猝滅常數(shù),結(jié)果見圖3和表1。

圖3 DDAB與IgG作用的Stern-Volmer圖Figure 3 Stern-Volmer plots of the interaction between DDAB and IgG

表1結(jié)果顯示,猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小,表明猝滅機制為靜態(tài)猝滅過程。

為驗證猝滅類型,依據(jù)方程(1)計算出Kq值(見表1)。由于生物大分子熒光壽命約為10-8s,298.15 K時,Kq計算值為1.86×1012L/(mol·s)。而各類猝滅劑與生物分子的最大碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s),表明DDAB對IgG的猝滅過程常數(shù)大于擴散控制的速率常數(shù)。所以DDAB對IgG的猝滅屬靜態(tài)猝滅,即DDAB與IgG在基態(tài)時形成了復(fù)合物,引起IgG構(gòu)象發(fā)生改變。

2.2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù) 靜態(tài)猝滅的結(jié)合常數(shù)Ka由修正的Stern-Volmer方程(2)計算而得:

(2)

表1不同溫度下DDAB與IgG作用的猝滅常數(shù)KSV

Table1QuenchingconstantsfortheinteractionofDDABwithIgGatdifferenttemperatures

溫度(K)Stern-Volmer方程動態(tài)猝滅常數(shù)KSV/(L/mol)相關(guān)系數(shù)r雙分子猝滅速率常數(shù)Kq[L/(mol·s)]298.15F0/F=1.86×104[Q]+0.99711.86×1040.99881.86×1012303.15F0/F=1.70×104[Q]+0.98191.70×1040.99431.70×1012310.15F0/F=1.38×104[Q]+1.00451.38×1040.99521.38×1012

式中,F0和F分別是未加入和加入DDAB時IgG的熒光強度;Ka為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點數(shù);[Q]為DDAB的濃度。計算結(jié)果見表2。

表2不同溫度下DDAB與IgG作用的的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n

Table2Bindingconstants(Ka)andsitenumbers(n)fortheinteractionofDDABwithIgGatdifferenttemperatures

溫度/K修正的Stern-Volmer方程結(jié)合常數(shù)Ka(L/mol)結(jié)合位點數(shù)n相關(guān)系數(shù)r298.15lg[(F0-F)/F]=4.67+1.09lg[Q]4.67×1041.090.9995303.15lg[(F0-F)/F]=4.46+1.06lg[Q]2.88×1041.060.9989310.15lg[(F0-F)/F]=4.27+1.00lg[Q]1.86×1041.000.9958

表2結(jié)果表明,Ka隨溫度升高而減小,說明溫度升高時DDAB與IgG結(jié)合能力減弱,進一步證明DDAB對IgG熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅過程。同時,由表2可知n都在1附近,說明DDAB與IgG結(jié)合時是1 ∶1結(jié)合;但隨溫度升高,n減小,說明溫度升高,DDAB與IgG結(jié)合程度減弱,與Ka結(jié)果相符。

2.2.4 DDAB與IgG的結(jié)合作用力研究 為了考察DDAB與IgG的結(jié)合作用力,可以通過計算結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)進行預(yù)測。在溫度變化不大時,可以近似認為反應(yīng)的焓變(ΔH)為常數(shù),根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)間的關(guān)系式(3)-式(5)[15]:

(3)

ΔG=-RTlnKa

(4)

(5)

分別計算得到ΔH,熵變(ΔS)和吉布斯自由能變(ΔG)。式中:Ka為結(jié)合常數(shù);R為氣體摩爾常數(shù);ΔH、ΔS及ΔG計算結(jié)果見表3。

表3不同溫度下DDAB與IgG作用的熱力學(xué)參數(shù)

Table3ThermodynamicparametersfortheinteractionofDDABwithIgGatdifferenttemperatures

溫度(K)ΔH(kJ/mol)ΔS[J/(mol·K)]ΔG(kJ/mol)298.15-59.780-161.68-11.576303.15-160.07-11.255310.15-157.23-11.015

依據(jù)Ross與Subramanian判斷小分子與生物大分子作用力類型的規(guī)律[16],可知,DDAB與IgG結(jié)合時氫鍵和范德華力起主要作用。

2.3 DDAB對IgG構(gòu)象的影響

2.3.1 同步熒光光譜 同步熒光光譜因具有簡化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點而常用來探討蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。Δλ為15 nm和60 nm時所得同步熒光光譜分別表示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征,這兩種氨基酸的最大發(fā)射波長與其所處的微環(huán)境的極性有關(guān),若其所處環(huán)境的疏水性逐漸降低,則最大發(fā)射波長會發(fā)生紅移,反之,則發(fā)生藍移。因此,根據(jù)最大發(fā)射波長的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。實驗結(jié)果見圖4。

圖4顯示,IgG的同步熒光峰隨DDAB濃度的增加而降低。其中,酪氨酸殘基熒光發(fā)射峰由291 nm紅移到293 nm,色氨酸殘基發(fā)射峰由276 nm紅移至278 nm,說明兩種氨基酸殘基周圍的疏水性都降低,其原因是DDAB的加入使得IgG構(gòu)象發(fā)生改變。

2.3.2 圓二色譜 DDAB與IgG作用的圓二色譜見圖5。IgG在206 nm有1個正峰,在217 nm有1個負槽,這是典型β-折疊結(jié)構(gòu)的特征表現(xiàn)。當加入DDAB時,IgG的CD值有所減小,預(yù)示著IgG的肽鏈發(fā)生一定程度伸展,這與2.1.1熒光猝滅實驗一致;但并未靠近0線,且峰的形狀和位置基本不變,說明在研究濃度范圍內(nèi)DDAB對IgG β-折疊結(jié)構(gòu)影響不大。

3 討論

脂質(zhì)體是一種多功能藥物載體,能使藥物具有靶向性,降低藥物不良反應(yīng),提高生物利用度,提高和延長療效,避免耐藥性和改變給藥途徑等。陽離子脂質(zhì)體由一個荷正電的兩性化合物(即陽離子脂質(zhì))及中性脂質(zhì)組成,是最具潛力的病毒載體替代品,在基因遞送中前景廣闊。新型陽離子類脂分子不斷涌現(xiàn),研究其血液安全性,將為增加陽離子脂質(zhì)體種類提供一定理論依據(jù)[17,18]。

A. Δλ=15nm, 酪氨酸殘基同步熒光光譜 B. Δλ=60 nm, 色氨酸殘基同步熒光光譜IgG濃度1.5 μmol/L;曲線1-10: DDAB濃度分別為0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 20.0 μmol/L;T=298.15 K圖4 DDAB與IgG相互作用的同步熒光光譜圖Figure 4 Synchronous fluorescence spectra of IgG upon addition of DDAB

IgG濃度1.5 μmol/L;曲線1-5：DDAB濃度分別為0, 4.0, 8.0, 12.0, 20.0 μmol/L;T=298.15 K圖5 DDAB對IgG圓二色譜的影響Figure 5 Effect of DDAB on circular dichroism spectra of IgG

血液組成復(fù)雜,其中血漿蛋白含量豐富,對血液功能的發(fā)揮起著不可忽視的作用。免疫球蛋白是血液中含量最豐富的免疫蛋白,參與外源性物質(zhì)在體內(nèi)的運送、分布、代謝及消除等過程,研究DDAB與IgG的相互作用,可以從分子水平評價陽離子類脂質(zhì)分子的血液安全性,為陽離子脂質(zhì)體的成功構(gòu)建提供指導(dǎo)。

蛋白質(zhì)的紫外吸收,主要來源于肽鍵對光的強烈吸收,此外組成氨基酸的側(cè)鏈基團(如Trp的吲哚基,Tyr的酚基)對光也有吸收。小分子化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合前后吸收光譜的差異,說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化,也可借此來推斷小分子化合物對蛋白熒光的猝滅機制[13]。IgG分子中的色氨酸和酪氨酸殘基是產(chǎn)生熒光的主要基團[19],可采用兩種氨基酸殘基的熒光猝滅來表征外源性小分子化合物與IgG的結(jié)合作用。同步熒光光譜能夠提供蛋白分子中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征信息,圓二色光譜是評價蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種簡單而有效的方法[20],因此可以利用兩種光譜對蛋白的構(gòu)象變化進行考察。

本工作采用多光譜聯(lián)用技術(shù),考察了DDAB與IgG之間的結(jié)合作用。DDAB使IgG的紫外吸收光譜發(fā)生減色效應(yīng),表明DDAB與IgG形成了復(fù)合物,引起IgG的構(gòu)象發(fā)生變化。從DDAB對IgG熒光光譜的影響,可以推測DDAB對IgG的熒光猝滅過程是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅,在形成DDAB-IgG復(fù)合物時,使IgG分子的多肽鏈發(fā)生一定程度的伸展,氨基酸殘基的微環(huán)境極性增大。熱力學(xué)計算結(jié)果表明,DDAB與IgG結(jié)合時ΔG<0,表明結(jié)合過程是自發(fā)進行的,而ΔH和ΔS均小于零說明DDAB與IgG之間通過氫鍵和范德華力產(chǎn)生了較強的結(jié)合作用[21]。DDAB與IgG的結(jié)合常數(shù)在104數(shù)量級,小于一般小分子化合物與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)[22],說明DDAB對IgG的β-折疊構(gòu)象影響較小,這與同步熒光和圓二色實驗結(jié)果完全相符,預(yù)示其可以作為陽離子脂質(zhì)體的組成成分。