韓廣書,余美玲,石慶平,武丹丹,孔令提,董淑英*,王 茹

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,蚌埠 233003;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科;3河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科;*通訊作者,E-mail:bbmcdsy@126.com;#共同通訊作者,E-mail:26163286@qq.com)

細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要現(xiàn)象,也是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤遷移、繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[1,2]。細(xì)胞發(fā)生EMT后,上皮細(xì)胞的分子標(biāo)記E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)水平會(huì)降低;發(fā)生EMT的細(xì)胞還常伴有間質(zhì)細(xì)胞來源蛋白質(zhì)的重新表達(dá)或表達(dá)水平增加,如波形蛋白(vimentin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、纖連蛋白(fibronectin)等,且細(xì)胞獲得了較高的遷移與侵襲能力[1]。研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)EMT可顯著降低其侵襲、轉(zhuǎn)移能力。課題組前期的研究結(jié)果也證實(shí),在HepG2/DOX細(xì)胞中過表達(dá)Cx32可逆轉(zhuǎn)EMT,降低其侵襲、轉(zhuǎn)移能力[1]。

縫隙連接蛋白32(connexin32,Cx32)是正常肝細(xì)胞中表達(dá)的主要連接蛋白(connexin,Cx),也是肝細(xì)胞縫隙連接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。細(xì)胞縫隙連接(gap junction,GJ)是細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道,廣泛存在于實(shí)質(zhì)性器官組織中。GJ由特殊的通道蛋白-連接蛋白(Cx)組成。肝細(xì)胞中表達(dá)的主要連接蛋白Cx32在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用[3-6]。本課題組的前期研究證實(shí)了在肝癌細(xì)胞中Cx32可調(diào)控EMT的發(fā)生[1]。但Cx32如何影響EMT還尚未闡明。報(bào)道指出,PI3K/Akt信號(hào)通路的持續(xù)激活能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生[7,8],PI3K/Akt信號(hào)通路也能調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT[9,10]。本研究通過測(cè)定HepG2細(xì)胞與HepG2/DOX細(xì)胞中p-Akt和總Akt的表達(dá)結(jié)果顯示,HepG2/DOX細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性顯著增強(qiáng),在此基礎(chǔ)上推測(cè)Cx32可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT。因此,本研究將探究PI3K/Akt信號(hào)通路在影響Cx32調(diào)控肝癌EMT過程中的作用,為肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2及阿霉素耐藥細(xì)胞株HepG2/DOX均購自上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自Gibco公司(美國)。Cx32過表達(dá)質(zhì)粒和shRNA干擾質(zhì)粒購于上海吉瑪基因有限公司?；|(zhì)膠(Matrigel)購自BD公司(美國),Transwell小室(直徑6.5 mm,孔徑8.0 mm)購自Costar公司(美國)。Connexin32一抗購自Abcam公司(英國),Akt、p-Akt、E-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗均購自CST公司(美國)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購于Bio-Rad公司(美國),ECL發(fā)光試劑盒購于Millipore公司(美國)。阿霉素(DOX)、DMSO(二甲基亞砜)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗均購自Sigma公司(美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2及阿霉素耐藥細(xì)胞株HepG2/DOX均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(青霉素1×105IU/L、鏈霉素100 mg/L)中,并放置于37 ℃、5% CO2和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,以1×105cells/ml的密度接種于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到60%左右時(shí),按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將shRNA-Cx32(5′-CUUCCAAGUUCCUAUAGAATT-3′)質(zhì)粒(shRNA-Cx32組)或Negative control(5′-AGCAACACATAGAGAAGAA-3′)質(zhì)粒(negative control組)轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞,其中對(duì)照組為單用Lipofectamine2000處理的HepG2細(xì)胞;將Cx32過表達(dá)質(zhì)粒的空質(zhì)粒(pcDNA組),Cx32過表達(dá)pcDNA-Cx32質(zhì)粒(pcDNA-Cx32組)轉(zhuǎn)入HepG2/DOX細(xì)胞中,其中對(duì)照組為單用Lipofectamine2000處理的HepG2/DOX細(xì)胞。細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h,換為含10%血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,以1×105cells/ml的密度接種于12孔板,收集細(xì)胞,加入適量的裂解液,冰上裂解30 min。4 ℃,12 000 r/min離心30 min,提取蛋白上清液,BCA法測(cè)定蛋白含量。每組取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)至PVDF膜;用5%脫脂牛奶封閉4 h;TPBS洗膜3次,每次5 min,加一抗p-Akt(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、Cx32(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶8 000),4 ℃孵育過夜;TPBS洗膜3次,加羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000),羊抗兔二抗(1 ∶2 000),二抗室溫下孵育2 h;TPBS洗膜3次,ECL試劑盒暗室發(fā)光顯影,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像,并用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度掃描,定量分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲及遷移能力

侵襲實(shí)驗(yàn):將Transwell小室置于24孔板,用無血清DMEM培養(yǎng)基按1 ∶6的比例稀釋Matrigel膠,稀釋后的膠按50 μl/孔均勻的鋪在小室的上室中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中,4-5 h后凝固待用。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,消化,離心細(xì)胞,用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,使成均勻的單細(xì)胞混懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞以5×105cells/ml接種于上室中,每個(gè)上室加入的體積為200 μl,每個(gè)小室的下室加入800 μl含血清的DMEM培養(yǎng)基,放入37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。12-24 h后取出Transwell小室,棄去內(nèi)室液體,用4%多聚甲醛固定小室膜上細(xì)胞15 min,0.2%結(jié)晶紫染色,10-30 min后用結(jié)晶紫潤濕的棉簽小心拭去上室內(nèi)沒穿過膜的細(xì)胞,在倒置顯微鏡(×200)下觀察,并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù),取均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):與侵襲實(shí)驗(yàn)不同的是小室上室不需要加鋪Matrigel膠,其他實(shí)驗(yàn)步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得到的各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均重復(fù)至少3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),多組間的數(shù)據(jù)比較采用方差分析,組間比較采用LSD-t法,P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)圖表采用Sigma plot 10.0繪制。

2 結(jié)果

2.1 Cx32影響肝癌細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的活性

為觀察Cx32對(duì)肝癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用,取HepG2和HepG2/DOX細(xì)胞(不做任何實(shí)驗(yàn)處理),Western blot測(cè)定細(xì)胞中p-Akt以及總Akt的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與HepG2細(xì)胞相比,HepG2/DOX細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見圖1),提示在耐藥株HepG2/DOX細(xì)胞中,PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。

為進(jìn)一步觀察Cx32在肝癌細(xì)胞中對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用,在HepG2細(xì)胞中干擾Cx32的表達(dá),在HepG2/DOX細(xì)胞中過表達(dá)Cx32,Western blot測(cè)定p-Akt、總Akt表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明:在HepG2細(xì)胞中干擾Cx32的表達(dá)后,與negative control組相比,shRNA-Cx32組細(xì)胞p-Akt的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見圖1),提示PI3K/Akt信號(hào)通路活性增強(qiáng),而在HepG2/DOX細(xì)胞中過表達(dá)Cx32后,與pcDNA組相比,pcDNA-Cx32組細(xì)胞p-Akt的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見圖1),提示PI3K/Akt信號(hào)通路活性降低。該結(jié)果說明在人肝癌細(xì)胞中,Cx32可調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。

與negative control組或pcDNA組比較,*P<0.05圖1 Western blot檢測(cè)Cx32對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響Figure 1 Effect of Cx32 on the activity of PI3K/Akt signaling pathway by Western blot

2.2 LY294002增加HepG2/DOX細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá),降低vimentin的表達(dá)

為觀察抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后HepG2/DOX細(xì)胞中E-cadherin、vimentin表達(dá)水平的變化,本研究使用20 μmol/L的PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002處理HepG2/DOX細(xì)胞24 h,Western blot測(cè)定p-Akt、E-cadherin、vimentin的表達(dá)水平。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,在LY294002組中使用LY294002處理HepG2/DOX細(xì)胞后,細(xì)胞p-Akt的表達(dá)水平降低了69.7%(P<0.05,見圖2),PI3K/Akt信號(hào)通路的活性受到抑制;與對(duì)照組相比,在LY294002組細(xì)胞中,上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平增加了169.5%(P<0.05,見圖2),間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin的表達(dá)水平降低了67.3%(P<0.05,見圖2)。結(jié)果說明,在HepG2/DOX細(xì)胞中抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后,細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)增加,vimentin的表達(dá)降低。

與對(duì)照組比較,*P<0.05圖2 Western blot檢測(cè)LY294002對(duì)HepG2/DOX細(xì)胞中E-cadherin、vimentin表達(dá)的影響Figure 2 Effect of LY294002 on the expressions of E-cadherin,vimentin in HepG2/DOX cells by Western blot

2.3 LY294002降低HepG2/DOX細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力

腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)其中一個(gè)重要的特征是侵襲、遷移能力增強(qiáng)。因此本研究進(jìn)一步觀察了LY294002抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性后,細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化。結(jié)果表明:LY294002處理細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比,LY294002組中HepG2/DOX細(xì)胞的侵襲、遷移能力顯著降低,細(xì)胞的侵襲和遷移能力分別降低40.2%和37.4%(P<0.05,見圖3)。這些結(jié)果提示,LY294002可逆轉(zhuǎn)HepG2/DOX細(xì)胞的EMT。

2.4 LY294002可阻斷shRNA-Cx32對(duì)HepG2細(xì)胞中E-cadherin,vimentin的調(diào)控作用

為進(jìn)一步探究Cx32是否通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT,本實(shí)驗(yàn)首先在HepG2細(xì)胞中干擾Cx32的表達(dá),Western blot測(cè)定E-cadherin、vimentin表達(dá)水平的變化,Transwell觀察細(xì)胞侵襲、遷移能力的改變。結(jié)果表明:在HepG2細(xì)胞中干擾Cx32的表達(dá)后,與negative control組相比,shRNA-Cx32組細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)水平降低了51.1%,vimentin的表達(dá)水平增加了118.2%(P<0.05,見圖4),且與negative control組相比,shRNA-Cx32組細(xì)胞的侵襲、遷移能力顯著增加,細(xì)胞的侵襲、遷移能力分別增加77.7%、72.2%(P<0.05,見圖5)。上述結(jié)果說明干擾Cx32可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT。進(jìn)一步在干擾Cx32的HepG2細(xì)胞中,用LY294002處理細(xì)胞24 h,Western blot測(cè)定E-cadherin、vimentin的表達(dá),Transwell測(cè)定細(xì)胞的侵襲、遷移能力;結(jié)果表明:LY294002處理細(xì)胞后,阻斷了干擾Cx32對(duì)HepG2細(xì)胞EMT的調(diào)控作用,與nega-tive control組相比,shRNA-Cx32+LY294002組E-cadherin、vimentin的表達(dá)水平均沒有顯著變化(P>0.05,見圖4),與negative control組相比,shRNA-Cx32+LY294002組細(xì)胞的侵襲、遷移能力也無顯著改變(P>0.05,見圖5)。該結(jié)果說明,LY294002可阻斷shRNA-Cx32對(duì)細(xì)胞EMT的調(diào)控作用,提示PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)了Cx32對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的調(diào)控。

與對(duì)照組比較,*P<0.05圖3 LY294002對(duì)HepG2/DOX細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 (×200)Figure 3 Effect of LY94002 on the invasive and migratory abilities of HepG2/DOX cells (×200)

與negative control組比較,*P<0.05;與shRNA-Cx32組相比,#P<0.05圖4 LY294002對(duì)shRNA-Cx32調(diào)控E-cadherin、vimentin表達(dá)的影響Figure 4 Effect of LY94002 on the shRNA-Cx32-mediated expression of E-cadherin and vimentin

3 討論

連接蛋白Cx被認(rèn)為是公認(rèn)的腫瘤抑制因素[11,12],目前人體組織中已發(fā)現(xiàn)有21種連接蛋白[13],在這21種連接蛋白中,Cx26,Cx32,Cx43分布較為廣泛,在正常肝細(xì)胞中主要表達(dá)Cx32、Cx26,其中Cx32表達(dá)占90%。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中Cx32和Cx26的表達(dá)水平會(huì)顯著降低。與報(bào)道一致,在前期的研究中通過Western blot測(cè)定HepG2細(xì)胞和HepG2/DOX細(xì)胞中Cx26和Cx32的表達(dá)水平,結(jié)果表明,兩種細(xì)胞均不表達(dá)Cx26,但與HepG2細(xì)胞相比,HepG2/DOX細(xì)胞中Cx32的表達(dá)水平顯著降低,且肝癌組織與相應(yīng)癌旁組織的免疫組化測(cè)定結(jié)果也顯示,肝癌組織中Cx32的表達(dá)水平顯著降低[14]。在HepG2/DOX細(xì)胞中過表達(dá)Cx32可以逆轉(zhuǎn)EMT、降低細(xì)胞的侵襲、遷移能力[1]。實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了Cx32是肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。

為探討Cx32影響EMT的機(jī)制,該研究測(cè)定了HepG2細(xì)胞和HepG2/DOX細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的活性,結(jié)果顯示HepG2/DOX細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的活性顯著升高。據(jù)報(bào)道,PI3K/Akt信號(hào)通路可以通過多種機(jī)制參與腫瘤EMT的發(fā)生[7,8]:①PI3K/Akt信號(hào)通路被激活后,增加snail、slug、twist等核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),直接抑制E-cadherin的表達(dá);②PI3K/Akt誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),降解E-cadherin;③PI3K/Akt與其他信號(hào)途徑如wnt/β-catenin、Notch信號(hào)途徑間接或協(xié)同作用誘導(dǎo)EMT。本研究在HepG2細(xì)胞中干擾Cx32的表達(dá),PI3K/Akt信號(hào)通路活性顯著升高,在HepG2/DOX細(xì)胞中過表達(dá)Cx32,PI3K/Akt信號(hào)通路活性被抑制,提示Cx32可調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。前期的另一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞和HepG2/DOX細(xì)胞中Src/FAK信號(hào)通過也受Cx32的影響,PI3K/Akt是Src/FAK信號(hào)的下游通路,Cx32通過Src/FAK-PI3K/Akt信號(hào)通路軸逆轉(zhuǎn)HepG2/DOX細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥[14]。因此,推測(cè)Cx32可能是通過Src/FAK間接影響了PI3K/Akt的活性,從而影響EMT。因?yàn)樵诟伟┑陌l(fā)生、發(fā)展過程中Cx32會(huì)從正常的胞膜轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)[3],而Src能被胞質(zhì)中的蛋白激活[15]。當(dāng)然也不能排除Cx32對(duì)PI3K/Akt的直接調(diào)控作用。為驗(yàn)證以上假設(shè),將會(huì)在未來的研究中進(jìn)一步探討。

與negative control組比較,*P<0.05;與shRNA-Cx32組相比,#P<0.05圖5 LY294002對(duì)shRNA-Cx32調(diào)控HepG2細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響Figure 5 Effect of LY94002 on the shRNA-Cx32-mediated invasive and migratory abilities of HepG2 cells

前期的研究結(jié)果還顯示在HepG2/DOX細(xì)胞中過表達(dá)Cx32后NF-κB活性被抑制[14],PI3K/Akt可調(diào)控NF-κB的活性,NF-κB活性被激活后,snail的表達(dá)水平增加[16],從而抑制E-cadherin的表達(dá),且可降解E-cadherin的基質(zhì)金屬蛋白酶,如MMP-9的表達(dá)也受NF-κB調(diào)控[17],因此推測(cè)在肝癌細(xì)胞中Cx32可能是通過Src/FAK-PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)軸影響了EMT的發(fā)生。在肺癌細(xì)胞中我們便證實(shí)了PI3K/Akt/NF-κB通路的激活可促進(jìn)EMT[18]。

總之,本研究初步證實(shí)了Cx32通過PI3K/Akt信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,結(jié)合以往的研究提出了進(jìn)一步假設(shè):Cx32可能通過Src/FAK-PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)軸調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT。在下一步研究中會(huì)通過更多的實(shí)驗(yàn)去證實(shí),如干擾、過表達(dá)Akt改變PI3K/Akt信號(hào)通路的活性后,進(jìn)一步觀察該通路在Cx32影響肝癌EMT中的作用。該研究將揭示肝癌EMT發(fā)生的機(jī)制,為肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的治療提供理論依據(jù)。