孫 磊,陳珊珊,王 李,章福彬

(解放軍105醫(yī)院急診科,合肥 230000;*通訊作者,E-mail:fubinzhang2017@163.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和肺炎等炎癥性肺病是常見的危及生命的疾病,具有高發(fā)病率和死亡率;ALI是急性呼吸衰竭的主要原因,常伴有多器官衰竭[1,2]。ALI的特征是肺泡-毛細(xì)血管屏障通透性增加,包括毛細(xì)血管內(nèi)皮的廣泛破壞,導(dǎo)致肺水腫伴富含蛋白質(zhì)的液體外滲和間質(zhì)性肺水腫,表現(xiàn)為彌漫性肺泡實(shí)質(zhì)損傷和急性肺損傷。此外,當(dāng)肺泡基底膜受損并且液體滲入腔隙時(shí),可以導(dǎo)致肺通氣-灌注失衡[3]。近年來,隨著國內(nèi)外研究學(xué)者對急性肺損傷的研究深入,越來越多的分子機(jī)制參與ALI的發(fā)生發(fā)展,包括細(xì)胞凋亡、壞死、自噬以及炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體屬于NOD家族中最具特征性的炎癥小體,多種刺激因子包括過量的ATP,葡萄糖,活性氧(ROS)等內(nèi)源性刺激以及細(xì)菌鞭毛蛋白等外源性刺激均可誘導(dǎo)激活NLRP3炎癥體[4]。NLRP3炎癥小體通過與pro-caspase-1結(jié)合激活pro-caspase-1裂解成具有酶樣活性的caspase-1,并介導(dǎo)IL-1β和IL-18成熟和釋放,從而在炎癥反應(yīng)和促炎性程序性細(xì)胞死亡中起重要作用[5]。ROS是重要的NLRP3激活劑,而在急性肺損傷中,ROS的過量產(chǎn)生可以加重肺損傷并促進(jìn)肺纖維化,相關(guān)研究也表明,NLRP3在LPS誘導(dǎo)的ALI中表達(dá)上調(diào),參與ALI的發(fā)生發(fā)展[6]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是ROS的特異性清除劑,是一種硫醇化合物與巰基和谷胱甘肽的前體,NAC被用于抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生,通過調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)從而調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7]。然而,關(guān)于NAC在LPS誘導(dǎo)的ALI中的作用機(jī)制以及與NLRP3炎性體的作用關(guān)系目前尚不清楚,因此,本研究通過建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的SD大鼠ALI模型,并用NAC進(jìn)行預(yù)處理,探究NAC在LPS誘導(dǎo)大鼠ALI中的作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LPS粉劑(美國Sigma公司);NAC粉劑(美國Sigma公司);髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、乳酸脫氫酶(LDH)、白細(xì)胞介素18(IL-18)ELISA試劑盒(南京建成),NLRP3和IL-1β一抗(美國abcam公司)、caspase-1和ASC一抗(美國santa公司),GAPDH一抗(美國CST公司),酶標(biāo)儀(美國Perkin Elmer公司),Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.2 動(dòng)物動(dòng)物與模型建立

32只成年雄性SD大鼠(6-8周齡,220-250 g),購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(生產(chǎn)許可證號:SCXX(湘)2011-0003)。隨機(jī)分為對照組、急性肺損傷模型組、NAC對照組(NAC預(yù)處理)和NAC處理組(NAC預(yù)處理+急性肺損傷模型),每組8只。模型組和NAC處理組大鼠采用腹腔注射脂多糖LPS(5 mg/kg)建立急性肺損傷模型,對照組和NAC對照組腹腔注射等量生理鹽水;NAC對照組和NAC處理組于生理鹽水或LPS注射前30 min腹腔注射20 mg/kg NAC。生理鹽水或LPS腹腔注射后24 h,收集各組大鼠血清和肺組織標(biāo)本進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3 肺濕/干重比(W/D)測定

1%戊巴比妥鈉麻醉下迅速取出右肺上葉,用濾紙吸干表面水分,稱取肺組織濕重(W),置于75 ℃恒溫烤箱中烘烤48 h至恒重,測定肺組織干重(D),計(jì)算右肺上葉W/D。

1.4 血清MPO、LDH、TNF-α、IL-18水平測定

1%戊巴比妥鈉麻醉下經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈采集頸動(dòng)脈血,離心收集血清,-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定MPO、LDH、TNF-α、IL-18活性,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 肺泡灌洗液中MPO、TNF-α、LDH、IL-18檢測

在1%戊巴比妥鈉麻醉下結(jié)扎肺門,使用預(yù)冷的PBS進(jìn)行左肺支氣管-肺泡灌洗,回收支氣管肺泡灌洗液(BALF),1 500 r/min,離心15 min,取上清分裝,于-80 ℃冰箱保存。按照MPO、LDH、TNF-α、IL-18活性檢測試劑盒說明檢測相關(guān)活性。

1.6 肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)檢測

在1%戊巴比妥鈉麻醉下取肺組織,迅速凍存于液氮中,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。Western blot檢測肺組織NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)水平。取肺臟組織80 mg,加入800 μl RIPA裂解液,冰上裂解30 min,再冰浴下電動(dòng)勻漿,4 ℃,12 000 g離心15 min,取上清,用BCA法測定蛋白濃度。加5×上樣緩沖液混勻煮沸10 min。用SDS-PAGE分離蛋白,電轉(zhuǎn)于PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別使用NLRP3一抗(1 ∶1 000)、caspase-1一抗(1 ∶200)、ASC一抗(1 ∶200)、IL-1β一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次,每次10 min,熒光二抗(1 ∶10 000,Li-Cor)室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次10 min。用odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀(Li-Cor公司,美國)掃描熒光蛋白條帶,通過目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織干濕比比較

LPS處理后24 h,與對照組大鼠相比,LPS誘導(dǎo)的模型組大鼠的肺組織干濕比明顯增加(P<0.01);且與模型組相比,NAC處理組大鼠肺組織干濕比顯著下降(P<0.01);對照組和NAC對照組大鼠肺組織干濕比無明顯差異,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

2.2 各組大鼠血清MPO、LDH、TNF-α、IL-18水平

與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01圖1 各組大鼠肺組織W/d比較Figure 1 Comparison of lung W/d among four groups

與對照組比較,ALI模型組大鼠血清中MPO、LDH水平明顯升高(P<0.01),炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-18水平也顯著增高;且與模型組比較,NAC處理組MPO、LDH水平明顯降低(P<0.01),炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-18也明顯降低。對照組和NAC對照組間大鼠血清MPO、LDH、TNF-α、IL-18水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

與對照組相比,**P<0.01;與模型組相比,##P<0.01圖2 各組大鼠血清MPO、LDH、TNF-α、IL-18含量比較Figure 2 Comparison of serum MPO, TNF-α, LDH and IL-18 level among four groups

2.3 各組大鼠BALF中MPO、TNF-α、LDH、IL-18水平

與對照組比較,ALI模型組BALF中MPO、LDH水平顯著升高(P<0.01),炎癥因子TNF-α、IL-18水平也顯著升高(P<0.01);且與模型組組比較,NAC處理組大鼠BALF中MPO、TNF-α、LDH、IL-18水平明顯降低(P<0.01)。對照組和NAC對照組兩組大鼠BALF中MPO、TNF-α、LDH、IL-18平無明顯差異,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

與對照組相比,**P<0.01;與模型組相比,##P<0.01圖3 各組大鼠鼠BALF中MPO、TNF-α、LDH、IL-18含量比較Figure 3 Comparison of BALF MPO, TNF-α, LDH and IL-18 levels among four groups

2.4 各組大鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β表達(dá)水平

與對照組大鼠相比,ALI模型組大鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);且與模型組相比,NAC處理組肺組織NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著下降。對照組和NAC對照組兩組大鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)水平無明顯差異,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。

與對照組相比,**P<0.01;與模型組相比,##P<0.01圖4 各組組大鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)水平比較Figure 4 Comparison of NLRP3, caspase-1, ASC and IL-1β protein levels of lung tissue among four groups

3 討論

臨床上,多種因素如細(xì)菌感染、外傷、失血性休克、輸血和吸入性肺炎等均可以引起ALI的發(fā)生。脂多糖是一種脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物,是內(nèi)毒素和重要群特異性抗原(O抗原),其作為膿毒血癥的重要介質(zhì),腹腔注射后可以通過血液循環(huán)可以引起白細(xì)胞遷徙活動(dòng)增強(qiáng),白細(xì)胞可以促進(jìn)并釋放趨化性細(xì)胞因子進(jìn)入支氣管肺泡灌洗液(BAL),中性粒細(xì)胞浸潤和激活,組織炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大,從而介導(dǎo)急性肺損傷[8,9]。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射LPS致大鼠急性肺損傷模型,結(jié)果顯示,與正常組比較,LPS誘導(dǎo)急性肺損傷組大鼠肺組織腔內(nèi)出現(xiàn)大量滲出物,大量水腫液形成,肺間質(zhì)增寬,中性粒細(xì)胞浸潤,肺W/d明顯增加;并且肺泡灌洗液和血清中MPO、LDH活性顯著升高;表明本實(shí)驗(yàn)中LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型制備成功。

近年來研究表明,LPS可以觸發(fā)TLR通路,從而誘導(dǎo)NF-κB等激活和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生是LPS誘導(dǎo)ALI發(fā)生的重要因素[10,11],而減少炎性細(xì)胞因子的表達(dá)以及TLR4信號通路可以顯著減輕ALI的嚴(yán)重程度[12]。本研究結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,LPS誘導(dǎo)急性肺損傷模型組大鼠肺泡灌洗液和血清中TNF-α和IL-18水平明顯增高,與相關(guān)研究結(jié)果一致[13]。本研究結(jié)果還表明,與LPS誘導(dǎo)急性肺損傷模型組相比,NAC預(yù)處理組大鼠肺損傷程度明顯減輕,肺W/D減少,肺泡灌洗液和血清中MPO、LDH水平降低,且TNF-α和IL-18水平顯著下調(diào)。這表明,NAC作為ROS抑制劑,通過下調(diào)TNF-α和IL-18水平而減輕肺組織炎癥反應(yīng),從而明顯減輕LPS誘導(dǎo)的ALI。

NLRP3是Nod樣家族受體,可以識別外源性和內(nèi)源性刺激因子如ATP、細(xì)菌毒素、微晶體物質(zhì)、脂質(zhì)顆粒、細(xì)菌、病毒和死亡細(xì)胞的組分等而介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)[14,15]。NLRP3炎性小體是由含有3的pyrin結(jié)構(gòu)域炎性蛋白NLRP3、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(pro-caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合物,活化的NLRP3炎性小體可以通過誘導(dǎo)pro-caspase-1募集,激活I(lǐng)L-1β成熟并促進(jìn)其釋放,從而介導(dǎo)組織細(xì)胞級聯(lián)炎癥反應(yīng)[16-18]。近年來研究表明,NLRP3在心臟、腎臟、肝臟缺血再灌注損傷,失血性休克誘發(fā)的ALI以及高血壓引起的心臟重塑等多種疾病中扮演著重要作用。NLRP3炎性小體在肺組織中含量非常豐富。研究表明,活化的NLRP3炎性體介導(dǎo)細(xì)胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18前體的成熟并釋放活性形式IL-1β、IL-18,這些生物活性細(xì)胞因子在ALI炎癥過程的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[19,20]。T?zsér等[21]研究證明LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體活性明顯增加,IL-1β和IL-18水平增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS誘導(dǎo)ALI模型組大鼠肺組織損傷嚴(yán)重,并且肺組織中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)水平顯著增高。因此,表明NLRP3炎性體在LPS誘導(dǎo)的ALI中活性增高,活化的NLRP3炎性體介導(dǎo)下游IL-1β等炎性因子和細(xì)胞因子釋放,從而激活肺組織炎癥反應(yīng)而參與ALI。

近年來研究證實(shí),活性氧ROS是NLRP3炎性小體的上游因子[22],ROS可以直接或者間接激活NLRP3炎性體,抑制ROS產(chǎn)生可以明顯抑制NLRP3炎性體的活化[23]。Li等[24]研究也表明,過度和/或持續(xù)的Ca2+流入可能引起線粒體鈣超載,導(dǎo)致線粒體損傷和高水平的ROS產(chǎn)生,抑制Ca2+動(dòng)員可以減少mtROS產(chǎn)生并減少活化的NLRP3炎性小體。在肺組織損傷中的研究表明,不同刺激物的信號參與離子平衡、溶酶體失調(diào)和線粒體損傷途徑,導(dǎo)致組織蛋白酶的釋放和ROS的產(chǎn)生,ROS可以加重肺損傷[25]。NAC可以抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生,通過調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)從而調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)[26]。Choi等[27]研究表明,NAC可以抑制LPS誘導(dǎo)的ALI,具體機(jī)制尚未完全明確。本研究中,在LPS注射前30 min經(jīng)腹腔注射NAC進(jìn)行預(yù)處理,結(jié)果表明,NAC預(yù)處理組大鼠肺組織損傷明顯減輕,肺泡灌洗液和血清中MPO、LDH、TNF-α和IL-18水平下降,且肺組織NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β水平明顯下調(diào)。本研究結(jié)果表明,NAC作為ROS抑制劑,可以抑制NLRP3炎性體激活,從而抑制下游IL-1β等炎性因子的成熟和釋放,減輕肺組織炎癥反應(yīng)和損傷,從而介導(dǎo)ALI的保護(hù)作用。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)表明NAC預(yù)處理可以減少LPS誘導(dǎo)的ALI,其作用機(jī)制可能是通過抑制NLRP3炎性體激活從而減輕其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),這可以為臨床預(yù)防和治療ALI提供新方向和靶點(diǎn)。