王江平，王勤章，焦 勇，許志斌△

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院泌尿外科(西安 710038)，2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(石河子 832000)

主題詞 尿道/生理學(xué) Cajal間質(zhì)細(xì)胞 交感神經(jīng) 平滑肌 豚鼠

尿道平滑肌收縮可以產(chǎn)生足夠的尿道壓力，在排尿和射精過程中起著重要的作用。由于尿道平滑肌收縮是由自主神經(jīng)興奮引起的，探索尿道的神經(jīng)信號(hào)的調(diào)控機(jī)制是研究后尿道壓力異常引起諸如前列腺增生癥、早泄等相關(guān)疾病的熱點(diǎn)之一。近年來，在尿道中發(fā)現(xiàn)一種在形態(tài)和免疫學(xué)上類似于胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)的特殊細(xì)胞被稱為尿道ICC[1-2]。在胃腸道，ICC不僅充當(dāng)平滑肌自主興奮的起搏器，同時(shí)也作為“信號(hào)中轉(zhuǎn)站”介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)至平滑肌，參與平滑肌活動(dòng)的調(diào)控[3-4]。交感神經(jīng)是尿道平滑肌主要的興奮性神經(jīng)，本研究通過形態(tài)學(xué)和功能學(xué)研究初步證實(shí)豚鼠尿道ICC具有介導(dǎo)交感神經(jīng)信號(hào)，調(diào)控尿道平滑肌收縮的功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 材 料 成年豚鼠5只，體重350～500 g。大鼠抗小鼠c-Kit抗體(1∶200；Millipore，美國(guó))，兔抗小鼠-actin抗體(1∶400；Abcam，美國(guó))，兔抗DβH抗體(1∶200；Santa Cruz，美國(guó))，兔抗α1-腎上腺受體(1∶400；Abcam，美國(guó))，兔抗Cx-43抗體(1∶400；Abcam，美國(guó))，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗大鼠抗體(1∶200；北京中杉金橋)和TRITC標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶200；北京中杉金橋)，Glivec (諾華，瑞士)。

2 方 法

2.1 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)：①腹腔內(nèi)注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉將豚鼠麻醉后處死，立即解剖、取出后尿道；②將后尿道組織包埋，冰凍切片機(jī)上制作20 μm 切片，貼附于載玻片上，在4 ℃丙酮中浸泡15 min；③用1∶100胎牛血清封閉，孵育80 min，分別滴加c-Kit抗體和-actin抗體混合液，c-Kit抗體和DβH抗體混合液，c-Kit抗體和α1-腎上腺素受體抗體混合液，c-Kit抗體和Cx-43抗體混合液，在4 ℃環(huán)境中孵育12 h；④加FITC和TRITC標(biāo)記的混合二抗，置于25 ℃濕盒內(nèi)避光孵育60 min；⑤封片后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，F(xiàn)ITC激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，TRITC激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm，使用Zeiss LSM 軟件保存、分析圖片。

2.2 體外肌條實(shí)驗(yàn)：50 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉豚鼠后，取后尿道組織，在Kreb液中漂洗后持續(xù)給予97% O2和 3% CO2。每只豚鼠取5 mm×2 mm×1 mm肌條各2條，兩端絲線固定，一端固定于孵育槽底部，一端連接于張力換能器上，給予1 g負(fù)荷，孵育1 h。張力換能器信號(hào)輸入四通道生理記錄儀，加入50 μmol/L的去甲腎上腺素誘發(fā)肌條收縮，記錄肌條收縮的頻率和幅度曲線15 min。向孵育槽中分別加入50、200 μmol/L的Glivec抑制尿道肌條ICC功能后，分別記錄肌條收縮的頻率和幅度曲線各15 min。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每只豚鼠取2個(gè)，共10個(gè)尿道肌條，肌條實(shí)驗(yàn)記錄每個(gè)肌條收縮的頻率和幅度，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)使用不同濃度的Glivec前、后各組數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示在豚鼠尿道平滑肌層內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞，這些c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞和胃腸道ICC的一般形態(tài)學(xué)特征相似，細(xì)胞呈紡錘形或星形(圖 1)，胞體約20 μm，細(xì)胞兩端有明顯細(xì)長(zhǎng)的突起，細(xì)胞漿染色，少量細(xì)胞漿包繞在細(xì)胞核周圍，細(xì)胞核大，呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，占細(xì)胞大部分2/3以上體積且未被c-Kit抗體標(biāo)記、染色(圖 2，3)。DβH染色陽(yáng)性的交感神經(jīng)纖維一呈網(wǎng)絡(luò)狀分布(圖 1)。尿道ICC和平滑肌束走形方向一致，和交感神經(jīng)纖維一起伴行呈網(wǎng)絡(luò)狀平行分布，兩者之間存在密切接觸(圖 1)。尿道ICC與平滑肌細(xì)胞也密切接觸(圖 2)，ICC肌動(dòng)蛋白染色陰性(圖 2)。免疫熒光雙標(biāo)記染色還顯示在c-Kit標(biāo)記陽(yáng)性的ICC上還同時(shí)表達(dá)交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素的α1-腎上腺受體以及縫隙連接蛋白Cx-43(圖 3)。

A、D：尿道中的 c-Kit陽(yáng)性ICC(綠色)；B、E：尿道中的DβH陽(yáng)性交感神經(jīng)纖維(紅色)；C、F：親密關(guān)系交感神經(jīng)纖維和ICC之間存在密切的形態(tài)學(xué)聯(lián)系(白色箭頭)

A、B：ICC(綠色)位于尿道平滑肌纖維束(紅色)之間，與平滑肌細(xì)胞邊緣密切接觸

2 體外肌條實(shí)驗(yàn)結(jié)果 50 μmol/L的去甲腎上腺素可以穩(wěn)定地誘發(fā)尿道肌條收縮，收縮幅度為(1.26±0.15g)，收縮頻率為 (2.55±0.27) min-1。使用50、200 μmol/L Glivec 抑制ICC功能后尿道肌條的收縮幅度為(0.85±0.11)g、(0.38±0.07)g。使用50、200 μmol/L Glivec抑制ICC功能后尿道肌條的收縮頻率為(2.52±0.19)min-1、(2.66±0.29)min-1。Glivec明顯降低了尿道肌條收縮的幅度(P<0.01)，但對(duì)收縮的頻率未產(chǎn)生顯著影響 (P>0.05) (圖 4)。

A、D：尿道中的 c-Kit陽(yáng)性ICC(綠色)。B：α1-腎上腺受體(紅色)在尿道中的表達(dá)。E：Cx-43(紅色)在尿道中的表達(dá)。C：尿道中c-Kit和α1-腎上腺受體共表達(dá)(橙色)。F：尿道中c-Kit和Cx-43共表達(dá)(黃綠色)。

A：應(yīng)用50 μmol/L Glivec 后NE誘發(fā)的尿道肌條收縮活動(dòng)的變化；B：應(yīng)用200 μmol/L Glivec 后NE誘發(fā)的尿道肌條收縮活動(dòng)的變化；C：Glivec可以降低NE誘發(fā)尿道肌條收縮的幅度(P<0.01)；D：Glivec對(duì)NE誘發(fā)尿道肌條收縮的頻率無明顯影響(P> 0.05)

討 論

在胃腸道，ICC插入腸神經(jīng)纖維及平滑肌細(xì)胞之間，傳遞、介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)，調(diào)控平滑肌活動(dòng)。膽堿能神經(jīng)元、P物質(zhì)陽(yáng)性神經(jīng)元等興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元都與ICC之間存在密切的形態(tài)學(xué)聯(lián)系[5-7]。和胃腸道不同，尿道平滑肌活動(dòng)的興奮性神經(jīng)元為交感神經(jīng)，探索交感神經(jīng)、ICC、平滑肌細(xì)胞之間的形態(tài)學(xué)聯(lián)系對(duì)于研究尿道平滑肌張力調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大量c-Kit陽(yáng)性ICC位于尿道平滑肌束之間，和交感神經(jīng)、平滑肌細(xì)胞關(guān)系密切，三者之間組成“交感神經(jīng)-ICC-平滑肌”結(jié)構(gòu)單位，這種類似胃腸道ICC介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)的結(jié)構(gòu)單位提示尿道ICC可能具有介導(dǎo)交感神經(jīng)信號(hào)調(diào)控平滑肌活動(dòng)的作用。

在胃腸道，神經(jīng)纖維和ICC之間的連接結(jié)構(gòu)為突觸樣連接。作為突觸后膜，ICC細(xì)胞膜上表達(dá)包括毒蕈堿受體(M2、M3)、神經(jīng)激肽受體(NK1、NK3)、腸血管活性肽受體(VIP-1，VIP-2)等多種神經(jīng)遞質(zhì)的受體[8-9]。去甲腎上腺素是尿道內(nèi)興奮性交感神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，主要通過刺激α1-腎上腺受體引起平滑肌收縮。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)尿道ICC細(xì)胞膜上表達(dá)α1-腎上腺素受體，說明ICC為臨近交感神經(jīng)纖維的靶細(xì)胞，交感神經(jīng)纖維可能通過突觸樣連接將神經(jīng)信號(hào)傳遞給ICC。

本研究發(fā)現(xiàn)豚鼠尿道ICC位于平滑肌肌束之間，和肌束邊緣的平滑肌細(xì)胞密切接觸，為尿道ICC介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)至平滑肌細(xì)胞提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。在胃腸道，連接ICC與平滑肌細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)為縫隙連接?？p隙連接蛋白Cx-43是縫隙連接的重要組成部分。這些縫隙連接允許第二信使以及離子等非滲透分子進(jìn)行膜間自由轉(zhuǎn)移來傳遞來進(jìn)行細(xì)胞間通訊。在胃腸道，ICC能通過這些低電阻通路迅速傳遞各種神經(jīng)信號(hào)至平滑肌細(xì)胞[10]。本研究表明，ICC位于尿道平滑肌束邊緣，和平滑肌細(xì)胞密切接觸，并且表達(dá)Cx-43，提示尿道ICC具有將神經(jīng)信號(hào)向臨近平滑肌細(xì)胞傳遞的結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)，但Cx-43是否就是ICC將交感神經(jīng)信號(hào)傳遞至平滑肌細(xì)胞的特殊通道仍需深入研究。

c-Kit是ICC特異性標(biāo)記物，抑制c-Kit可以抑制ICC的發(fā)育、起搏和神經(jīng)信號(hào)傳遞功能。Glivec是c-Kit特異性的抑制劑，常被用作研究ICC功能的工具性藥物[11]。本研究中我們使用Glivec可以抑制去甲腎上腺素誘發(fā)的尿道平滑肌收縮幅度，提示在肌條實(shí)驗(yàn)中抑制ICC功能后交感神經(jīng)遞質(zhì)誘發(fā)的尿道平滑肌收縮效應(yīng)也受到了抑制，間接證實(shí)了ICC在尿道中介導(dǎo)了交感神經(jīng)信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)平滑肌收縮。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示尿道ICC可能以α1-腎上腺受體和Cx-43為分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與交感神經(jīng)、平滑肌細(xì)胞組成“交感神經(jīng)-ICC-平滑肌”形態(tài)、功能單位，發(fā)揮介導(dǎo)交感神經(jīng)信號(hào)，調(diào)控尿道平滑肌活動(dòng)的功能，研究結(jié)果為深入研究尿道平滑肌調(diào)控機(jī)制以及尿道平滑肌異常活動(dòng)相關(guān)疾病提供了全新的切入點(diǎn)。