申茂磊,王勤章,鄭麗英,錢 成,徐 浩,錢 彪△
1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(石河子832000),2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院院內(nèi)感染控制辦公室(石河子832000),3.解放軍69235部隊(奎屯833200)
主題詞 腎結(jié)石 受體, 鈣敏感 乙二醇 因果律
腎結(jié)石是腎盞中的礦物質(zhì)沉積物,常沉積于腎乳頭,是泌尿科的常見病[1-2],且結(jié)石的形成原因難以明確,因此,研究結(jié)石形成機制是治療腎結(jié)石的重要突破點。草酸鈣是大多數(shù)結(jié)石的主要成分,高鈣尿癥,高草酸尿是主要的危險因素[3]。國內(nèi)外學(xué)者研究顯示,鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor,CaSR)可抑制腎小管對鈣離子的重吸收,從而導(dǎo)致高鈣尿,影響結(jié)石的形成[4-5]。推測CaSR表達異常可能與腎結(jié)石形成有關(guān),本課題組通過胃內(nèi)灌注乙二醇和氯化銨誘石劑,連續(xù)10周動態(tài)檢測Wistar雄性大鼠腎臟CaSR的表達情況,初步探討CaSR在乙二醇形成結(jié)石中的作用。
1 實驗材料 本研究中使用的所有雄性Wistar大鼠都是購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,6周齡左右,共60只,大鼠可自由獲取飲用水。所有大鼠在光照條件下(12 h光照和黑暗周期),溫度、濕度適宜的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表法將大鼠分成正常對照組(30只)和乙二醇組(30只)。
2 實驗方法
2.1 動物模型的建立:60只大鼠隨機分為正常對照組(2 ml生理鹽水灌胃2周)、乙二醇組(大鼠1%乙二醇飲水和2%氯化銨AC 2 ml灌胃2周)每組30只。標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng),飲用自來水。
2.2 病理學(xué)檢查:水合氯醛麻醉處死實驗大鼠,手術(shù)切取雙側(cè)腎,兩側(cè)腎臟各取一部分,用甲醛溶液固定并包埋于石蠟中,HE染色后通過普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化及腎小管區(qū)有無結(jié)石結(jié)晶,以判斷腎結(jié)石模型是否成功建立。按照安瑞華等[6]的判定腎臟結(jié)石標(biāo)準(zhǔn)的方法進行統(tǒng)計,0級被判為陰性,Ⅰ~Ⅳ級被判為陽性,若同一只大鼠的雙腎都是陽性時,則計為1次,觀察10周內(nèi)兩組大鼠的腎結(jié)晶情況。
2.3 Western blot檢測CaSR表達:取病理鑒定模型成功的另一部分腎臟用于做Western blot檢測。①將腎臟組織研磨,放入EP管中;②將蛋白裂解液移置1.5 ml EP管中,在4 ℃;③12 000 g條件下離心15 min,離心后緩慢吸取上清放液,移入到一個干凈的離心管中,置于-20℃冰箱中備用;④采用BCA法測定蛋白濃度。制備分離膠和濃縮膠,將樣品和Loading Buffer混勻100 ℃煮樣約5 min,加樣20μl,恒壓80 V電泳跑膠;⑤結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,用TBST進行5 min洗膜,共完成兩次,然后封閉1 h;⑥加入稀釋后的一抗,在4 ℃環(huán)境中,于搖床上慢慢搖動孵育過夜,TBST洗膜3次,每次5 min;⑦ECL發(fā)光試劑中顯色,然后進行顯影和定影,利用Quantity one軟件分析實驗圖片。
1 病理組織學(xué)檢查 1~2周兩組未發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積,第3周以后乙二醇組Wistar雄性大鼠腎小管內(nèi)發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積,且主要分布于近、遠曲小管,晶體顆粒大多呈零星散在分布,少部分晶體互相連接成片狀分布。第1~10周,對照組Wistar雄性大鼠腎臟內(nèi)未見晶體顆粒沉積(圖1)。1~10周,乙二醇組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性11只(59.1%),因乙二醇組Wistar雄性大鼠在第3周開始成石,而前二周已處死的Wistar雄性大鼠也存在成石的可能,所以在計算成石率時將前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計數(shù)之外,對照組均為陰性,乙二醇組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1 。
A:第9周乙二醇組 B :第9周對照組
表1 兩組Wistar雄性大鼠腎組織結(jié)晶分級[例(%)]
注:乙二醇組與對照組成石率相比,P<0.05
2 腎組織CaSR蛋白Western blot檢查結(jié)果 由條帶灰度值可發(fā)現(xiàn)CaSR在乙二醇組中持續(xù)表達,1~2周和對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,但是3~10周其灰度值逐漸增加且明顯高于對照組;1~10周,CaSR在對照組中雖然持續(xù)表達,但其灰度值卻未見明顯改變(圖2)。
A、C分別為第6、第9周對照組,B、D分別為第6、第9周乙二醇組;與第6周對照組相比,aP<0.05; 與第9周對照組相比,bP<0.05
泌尿系結(jié)石是泌尿外科住院病人中最常見的原因,其中腎結(jié)石是最常見的病因之一。腎結(jié)石發(fā)病率及流行率在世界范圍內(nèi)又增加的趨勢,有研究顯示可能與感染、激素、骨橋蛋白、性別、年齡、種族密切相關(guān)[7-12],但其形成機制仍不明確,近年來眾多學(xué)者對CaSR的研究為我們研究腎結(jié)石的形成機制提供了新思路。
CaSR是在20余年前被發(fā)現(xiàn)的,能夠維持生理機體離子鈣濃度,其在腎臟中高表達,與尿鈣吸收、排泄密切相關(guān),也在腎臟之外的臟器中表達如骨、甲狀腺等[13-14]。CaSR在腎臟排泄鈣離子的過程起著關(guān)鍵作用[15]。
實驗發(fā)現(xiàn),乙二醇組造模期間有2只大鼠死亡,此結(jié)果可能于乙二醇及氯化銨的腎毒性有關(guān)。造模早期各組大鼠無特殊變化;造模3~8周時,正常對照組無特殊表現(xiàn),乙二醇組出現(xiàn)煩躁,活動增加。第8~10周乙二醇組出現(xiàn)精神疲倦,活動度減少,食量減少;正常對照組無特殊表現(xiàn),此表現(xiàn)可能與乙二醇及氯化銨造成腎臟損傷有關(guān)。腎臟病理切片發(fā)現(xiàn),乙二醇組大鼠腎臟內(nèi)從第3周起可見鈣鹽結(jié)晶沉積, 主要分布于腎小管, 而1~10周正常對照組大鼠腎組織未見晶體, 乙二醇組結(jié)石分析成石率較正常對照組高。乙二醇組腎臟腎小管內(nèi)鈣鹽晶體沉積較多,伴有部分腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性及小管上皮腫脹,可見腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤或腎小管上皮脫落;正常對照組腎臟組織未見病理改變。此結(jié)果與傳統(tǒng)乙二醇+氯化銨造模機制[16]相符,但本實驗的成石率卻較其低,因為本研究每周都處死大鼠,在處死的未形成大鼠里面有形成結(jié)石的可能。Western blot結(jié)果顯示乙二醇組腎臟CaSR的表達和對照組無明顯差異,但是3~10周乙二醇組腎臟CaSR的表達量明顯比正常對照組多,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。升高的CaSR能夠抑制腎小管對鈣離子的重吸收,從而導(dǎo)致高鈣尿,影響結(jié)石的形成[4-5]。這表明CaSR表達增強可能在結(jié)石形成中起重要作用。與以往乙二醇建立腎結(jié)石模型觀察CaSR的表達相比較,本實驗動態(tài)觀察CaSR的表達,增加結(jié)果可信度。
綜上所述,Wistar雄性大鼠在乙二醇灌胃2周后,CaSR的表達量逐漸增加,其抑制腎小管對鈣離子的重吸收,增加尿鈣,促進結(jié)石的形成。但CaSR是如何具體影響鈣離子排泄的,其具體作用機制仍有待進一步深入研究。