梁紅霞，余藝華，王 萌，石貞玉，皇甫超申，胡國(guó)強(qiáng)，厲永強(qiáng)，劉 彬

(河南大學(xué) 1. 護(hù)理與健康研究所、2. 藥學(xué)院、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004)

喹諾酮類抗感染藥物是一類細(xì)菌DNA回旋酶的抑制劑。真核生物的拓?fù)洚悩?gòu)酶氨基末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與原核生物回旋酶的β亞型具有較高的同源性，中間部分的結(jié)構(gòu)域與原核生物回旋酶的Iα亞基具有較高同源性[1]，這是抗菌氟喹諾酮改造為抗腫瘤化合物的理論依據(jù)[2]。本研究運(yùn)用電子等排體和拼接原理，應(yīng)用α,β-不飽和酮作為氟喹諾酮碳-3位羧基的生物等排體，設(shè)計(jì)合成了一系列溶解性好、分子質(zhì)量較小的的氟喹諾酮類查耳酮結(jié)構(gòu)類似物，并對(duì)該類化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，該類衍生物均具有較好的抗腫瘤活性，其中1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-[2-(3,4,5-三甲氧苯甲?；?-乙烯-1-基]-喹啉-4-(1H)-酮(HGQ7)活性最強(qiáng)(Fig 1)，其IC50值達(dá)4.952 μmol·L-1，具有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)的價(jià)值。近期已有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床常用的抗腫瘤藥物能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[3]，多數(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬作用對(duì)腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用，并能降低化療藥物的療效。抑制細(xì)胞自噬，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[4]。但某些抗腫瘤藥物利用自噬作用造成腫瘤細(xì)胞的死亡，并將這種作用稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[5]。因此，自噬現(xiàn)象已成為抗腫瘤藥物研究開(kāi)發(fā)中需要重視的問(wèn)題。課題組在對(duì)新合成化合物的篩選和研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)多數(shù)氟喹諾酮類衍生物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象。本研究應(yīng)用人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株，對(duì)HGQ7抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)自噬的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為該類藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig 1 Structure of 1-cyclopropyl-6-fluoro-7- (4-methyl-piperazin-1-yl)-3-[2-(3,4,5-trimethoxy-benzoyl)-vinyl-1-yl]-quinoliN-4(1H)-one

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，置5%的CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 HGQ7由河南大學(xué)化學(xué)生物學(xué)研究所合成，經(jīng)HPLC法測(cè)定純度>99%，HP5989A質(zhì)譜儀測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量為521.23。四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbi公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天試劑公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；氯喹(chloroquine，CQ)、羊抗兔HRP二抗(Santa Cruz公司)；兔抗LC3B多克隆抗體(Sigma公司)；驢抗兔Alexa Flour 488抗體(Abcam公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司)。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Ascent)；倒置顯微鏡(萊卡顯微系統(tǒng)公司)；BX51熒光顯微鏡(Olympus公司)；高速離心機(jī)(艾本德公司)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)；流式細(xì)胞儀(艾森生物公司)；電泳儀、半干式印跡膜轉(zhuǎn)印儀(六一電子儀器設(shè)備廠)。

1.2方法

1.2.1MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率 以細(xì)胞數(shù)1.5×107·L-1接種于96孔板，分別加入含HGQ7(0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μmol·L-1)和氯喹的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩至藍(lán)色晶體完全溶解，測(cè)定570 nm吸光度(OD)值并計(jì)算抑制率，以含有等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無(wú)細(xì)胞孔吸光度值為空白對(duì)照，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.2AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入400 μL 1×Binding buffer重新懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，室溫避光靜置15 min。加入10 μL PI染色液，冰浴避光靜置5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm。

1.2.3TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞以1.5×107·L-1接種于放有蓋玻片的6孔板中，每孔500 μL，設(shè)立HGQ7組(0、1.25、5.0 μmol·L-1)和HGQ7聯(lián)合氯喹組，同時(shí)收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，應(yīng)用ImageJ計(jì)算單位面積細(xì)胞總數(shù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4間接免疫熒光檢測(cè)LC3在BxPC-3細(xì)胞的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液制成6×107·L-1濃度的細(xì)胞懸液，接種多聚賴氨酸預(yù)處理爬片的6孔板，每孔3 mL。24 h后PBS洗滌，4%的多聚甲醛4℃冰箱固定，用含0.5% Triton X-100的PBS室溫?fù)u床孵育5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS洗滌，每片加入LC3抗體(1 ∶50)200 μL，4℃冰箱過(guò)夜；加入對(duì)應(yīng)的二抗Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔抗體(1 ∶300)200 μL，室溫避光孵育1 h，封片拍照。

1.2.5Western blot法檢測(cè)細(xì)胞LC3表達(dá) 取BxPC-3細(xì)胞，低溫提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，以20 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉。按1 ∶500濃度稀釋一抗，4℃搖床震蕩孵育過(guò)夜，按1 ∶5 000濃度稀釋二抗，室溫?fù)u床震蕩孵育2 h，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1HGQ7對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 2的MTT結(jié)果顯示，HGQ7處理BxPC-3細(xì)胞24、48 h，對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(P<0.05，P<0.01)，24 h和48 h的IC50分別為4.952 μmol·L-1和4.564 μmol·L-1。

Fig 2 Proliferation inhibition effect ofHGQ7 on BxPC-3 cells n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2HGQ7誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞凋亡Fig 3的Annexin V/PI檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.17%，HGQ7(1.25、5 μmol·L-1)處理24 h細(xì)胞凋亡率分別為30.82%、59.26%，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。Fig 4的TUNEL結(jié)果顯示，隨著HGQ7濃度增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3HGQ7對(duì)BxPC-3細(xì)胞自噬的影響Fig 5間接免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組BxPC-3細(xì)胞質(zhì)中的LC3綠色熒光亮點(diǎn)較弱，不同濃度HGQ7處理后，BxPC-3細(xì)胞熒光亮點(diǎn)明顯增加，表明HGQ7誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞發(fā)生自噬。Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ的表達(dá)量隨HGQ7處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在24 h達(dá)到最高，48 h時(shí)，LC3-Ⅱ表達(dá)量較之前明顯下降，表明HGQ7具有自噬誘導(dǎo)作用。

2.4氯喹對(duì)HGQ7抑制細(xì)胞增殖作用的影響如Fig 7所示，HGQ7及HGQ7聯(lián)合氯喹對(duì)BxPC-3細(xì)胞的增殖有抑制作用，在HGQ7低劑量(0.312 5～2.5 μmol·L-1)時(shí)，HGQ7聯(lián)合氯喹組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于HGQ7單獨(dú)處理組；而在HGQ7高劑量(5～10 μmol·L-1)時(shí)，HGQ7聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞增殖抑制率明顯低于HGQ7單獨(dú)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 3 The apoptotic rate of BxPC-3 cells aftertreatment with HGQ7 for 24 n=3)

Fig 4 Induction of apoptosis of BxPC-3 cells treated withHGQ7 for 24 h evaluated by TUNEL assay (×100)

Fig 5 Induction of autophagy of BxPC-3 cellstreated with HGQ7 for 24 h evaluated byan immunofluorescence assay (scale bar=50 μm)

Fig 6 Effects of HGQ7 (5.0 μmol·L-1) onLC3 expressions in BxPC-3 cells n=3)

*P<0.05,**P<0.01vs0 h group

Fig 7 Proliferation inhibition effect of HGQ7 andCQ on BxPC-3 cells

*P<0.05,**P<0.01vsHGQ7 group

2.5氯喹對(duì)HGQ7誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響Fig 8結(jié)果顯示，HGQ7(1.25 μmol·L-1)聯(lián)合氯喹組細(xì)胞凋亡率高于HGQ7單獨(dú)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HGQ7(5 μmol·L-1)聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞凋亡率低于HGQ7單獨(dú)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

本研究所選用的氟喹諾酮類化合物是以環(huán)丙沙星為原料，以舒尼替尼(索坦)為模板，利用活性拼接原理，合成11種氟喹諾酮-吲哚類查爾酮目標(biāo)化合物。一般認(rèn)為，經(jīng)改造的喹諾酮類抗腫瘤化合物是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒劑，與DNA斷裂片段及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，防止DNA再連接，造成DNA損傷[6]。本研究應(yīng)用MTT法檢測(cè)新合成的氟喹諾酮類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，前期共合成此類化合物11種，在不同濃度下對(duì)細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制作用，其中HGQ7對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，24 h的IC50值達(dá)4.952 μmol·L-1。為了進(jìn)一步觀察HGQ7對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用，又設(shè)置了48 h時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果顯示，在48 h時(shí)，IC50值達(dá)4.564 μmol·L-1，說(shuō)明具有藥物濃度和時(shí)間依賴性。TUNEL法進(jìn)一步觀察HGQ7對(duì)BxPC-3細(xì)胞的凋亡作用，熒光顯微鏡下觀察到隨著HGQ7濃度升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯上升，凋亡率也明顯增高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法的結(jié)果一致，說(shuō)明HGQ7對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡具有明顯誘導(dǎo)作用。

自噬在真核細(xì)胞的病理生理過(guò)程中廣泛存在，自噬細(xì)胞內(nèi)的溶酶體可以對(duì)一些受損、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及衰老細(xì)胞器進(jìn)行一系列的分解和再循環(huán)應(yīng)用[7]，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[8]。臨床常用的抗腫瘤藥物能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，多數(shù)自噬作用結(jié)果是對(duì)腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，但也有部分藥物通過(guò)自噬作用加速細(xì)胞進(jìn)入死亡程序，即所謂的Ⅱ型程序性死亡[9-10]。LC3是自噬的標(biāo)志物，其中LC3-Ⅱ含量與自噬泡的數(shù)量成正比。自噬進(jìn)展過(guò)程中，位于自噬體內(nèi)膜的LC3-Ⅱ和自噬體內(nèi)容物一起由溶酶體酶降解[11]。本實(shí)驗(yàn)選取LC3觀察HGQ7對(duì)BxPC-3細(xì)胞自噬的影響，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LC3的表達(dá)。結(jié)果顯示，HGQ7組反映LC3的綠色熒光斑點(diǎn)明顯高于對(duì)照組，斑點(diǎn)主要位于細(xì)胞核附近的細(xì)胞質(zhì)中，其數(shù)量增多、亮度增加，提示細(xì)胞中自噬體數(shù)量增加，說(shuō)明HGQ7能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。應(yīng)用Western blot對(duì)LC3的表達(dá)量作半定量分析，不同時(shí)間點(diǎn)的HGQ7濃度均為5.0 μmol·L-1，結(jié)果顯示，與0 h相比，在3、6、12、24 h的LC3-Ⅱ表達(dá)量逐漸增加，明顯高于對(duì)照組，但在48、72 h時(shí)，LC3-Ⅱ的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明定位于自噬體內(nèi)膜的LC3-Ⅱ隨著自噬過(guò)程的進(jìn)展進(jìn)入了溶酶體降解的過(guò)程。從自噬流的角度來(lái)看，自噬體增多有可能是由于自噬體的形成增加，也可能是其清除受阻所致[12]。為了進(jìn)一步了解自噬與細(xì)胞增殖及凋亡的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自噬抑制劑氯喹來(lái)阻斷自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體的過(guò)程[13]。為了有效利用氯喹研究自噬對(duì)藥物作用的機(jī)制，前期應(yīng)用MTT法已證明，在6.25 μmol·L-1濃度以下時(shí)，氯喹對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖的影響不明顯。應(yīng)用MTT法檢測(cè)HGQ7單獨(dú)處理BxPC-3細(xì)胞48 h，與HGQ7聯(lián)合氯喹處理細(xì)胞48 h后生長(zhǎng)抑制率的變化，結(jié)果顯示，在低劑量(0.312 5 ～2.5 μmol·L-1)時(shí)，HGQ7聯(lián)合氯喹組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于HGQ7單獨(dú)處理組，而在HGQ7高劑量(5.0 ～10 μmol·L-1)時(shí)，HGQ7聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯低于HGQ7單獨(dú)處理組。說(shuō)明低劑量HGQ7處理BxPC-3細(xì)胞，自噬對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，而在HGQ7高劑量時(shí)，自噬則促進(jìn)細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的驗(yàn)證采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，以不加任何藥物組和單獨(dú)氯喹組作為對(duì)照，1.25 μmol·L-1的HGQ7聯(lián)合氯喹組細(xì)胞凋亡率高于HGQ7單獨(dú)處理組，而5.0 μmol·L-1的HGQ7聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞凋亡率較HGQ7單獨(dú)處理組低，與MTT結(jié)果相吻合。提示HGQ7對(duì)BxPC-3細(xì)胞的作用中，自噬的影響與細(xì)胞凋亡有關(guān)，自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用依化合物濃度不同差別明顯，對(duì)其機(jī)制的闡明需進(jìn)一步研究。

Fig 8 Effects of HGQ7 andCQ on apoptosis of BxPC-3 cells n=9)

Representative images were taken(×100), nuclear stain(DAPI, A) and apoptotic stain (TUNEL, B) overlaid. 1: Control;2: CQ (6.25 μmol·L-1) 3: HGQ7 (1.25 μmol·L-1);4: HGQ7(1.25 μmol·L-1)+CQ (6.25 μmol·L-1);5: HGQ7 (5.00 μmol·L-1);6: HGQ7 (5.00 μmol·L-1)+CQ (6.25 μmol·L-1).#P<0.05vsHGQ7 (1.25 μmol·L-1) group;**P<0.01vsHGQ7 (5.00 μmol·L-1) group.

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河南大學(xué)護(hù)理與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，李曉華參與部分實(shí)驗(yàn)工作，特此致謝！)