低溫對(duì)不同基因型‘白雞冠’F1代葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h1>
2018-07-26 09:54林鄭和鐘秋生游小妹陳志輝陳常頌單睿陽(yáng)阮其春
茶葉學(xué)報(bào) 2018年2期
林鄭和，鐘秋生，游小妹，陳志輝，陳常頌，單睿陽(yáng)，阮其春
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)
茶樹原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)[1-2]，喜溫畏寒，對(duì)低溫比較敏感。近幾年全球氣溫變化不穩(wěn)定，而且茶葉消費(fèi)區(qū)域不斷擴(kuò)大，茶園種植面積不斷增多[3]，種植緯度北移。低溫凍害在我國(guó)茶樹栽培中易發(fā)常見(jiàn)，在南方地區(qū)(如廣東、福建、浙江等地)特別是倒春寒對(duì)茶葉的生產(chǎn)及其經(jīng)濟(jì)效益影響巨大。由于茶樹為多年生木本植物，選育一個(gè)良種周期較長(zhǎng)，主要是新種質(zhì)創(chuàng)制、早期的鑒定與開(kāi)發(fā)利用速度緩慢，以致新品種培育工作滯后。以往茶樹抗寒性的鑒定通常通過(guò)生化指標(biāo)的測(cè)定[3-4]，但步驟比較繁瑣。植物葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)是近年來(lái)新興的檢測(cè)植物光合作用生理狀況的技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在植物抗冷性、抗凍性方面也顯示出良好的應(yīng)用前景，已經(jīng)在花旗松[5]、玉米[6-7]、長(zhǎng)豇豆[8]、水稻[9-10]等作物上得到應(yīng)用。
典型的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線呈現(xiàn)O、J、I、P相[11]。有研究表明，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線是反映光合電子傳遞靈敏指標(biāo)及子傳遞的還原[12-13]。研究表明，OJ相反映了PSII受體側(cè)的還原[11,13]；JI相反映了PQ庫(kù)的還原[11,14]；IP相反映了PSI受體側(cè)還原的部分，被認(rèn)為是PSII受體側(cè)還原最后的限制速度的一步，其幅度可做為PSI含量的粗略指標(biāo)[15]。植物逆境下(低溫脅迫)葉片光合速率下降，并引起光能過(guò)剩，甚至導(dǎo)致光抑制的發(fā)生及光合機(jī)構(gòu)被破壞[15-16]。低溫敏感型番茄葉片在低溫下顯著影響PSⅡ反應(yīng)中心和電子傳遞，顯著降低了PSⅡ的活性，而對(duì)耐低溫野生番茄PSⅡ活性影響較小[17]。廣玉蘭[18]、小麥[19]等植物在低溫下也得出了類似的結(jié)果。低溫下冷敏感品種的西瓜[22]、水稻[23]反應(yīng)中心、天線系統(tǒng)、光合機(jī)構(gòu)受到傷害較耐冷品種嚴(yán)重，然而也有人研究發(fā)現(xiàn)[22]，低溫下各不結(jié)球白菜品系光化學(xué)效率的差異與電子傳遞的有效性是各品系抗冷性能差異的主要原因之一。Perks等[5]用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)檢測(cè)花旗松的凍害情況時(shí)，F(xiàn)v/Fm變化與針葉的傷害和存活率呈線性關(guān)系。也有人認(rèn)為，葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm與電解質(zhì)滲透率呈負(fù)相關(guān)，這也可作為鑒定植物抗寒性強(qiáng)弱的另一個(gè)指標(biāo)[11,15]。
‘白雞冠’為武夷山四大名叢之一，其F1代芽葉奇特，葉色淡綠，葉質(zhì)較脆，綠中帶白，茶葉顏色與眾不同，但抗寒性較差。有鑒于此，本文利用葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)白雞冠的F1代新品系進(jìn)行抗寒性篩選鑒定，為茶樹抗寒育種的早期鑒定提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)于2015～2016年在福建農(nóng)林大學(xué)資環(huán)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)選用5個(gè)白雞冠雜交創(chuàng)新種質(zhì)F1代0306F、0306I、0309B、0306C、0306D及黃棪(抗寒、抗旱都較強(qiáng))，每品種(系)選取生長(zhǎng)高度、長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲害的扦插苗(10月齡)。
1.2 低溫脅迫方法
將植株葉片用去離子水沖洗、擦凈后，用聚乙烯保鮮膜包裹。將每個(gè)品種(系)分為2組，放入智能人工氣候箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)中，一組放置在正常溫度(28℃)下生長(zhǎng)，另一組進(jìn)行低溫(0℃)脅迫處理，兩組光照強(qiáng)度和光照時(shí)間都相同，分別為300 μmol·m-2·s-1和12 h·d-1。
1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定
用英國(guó)生產(chǎn)的連續(xù)激發(fā)式葉綠素?zé)晒鈨x(Hansatech Handy PEA Hansatech Instruments Limited，Norfolk，UK)。OJIP曲線是由3400 μmol·m-2·s-1的紅光誘導(dǎo)的，紅光由3個(gè)發(fā)光二極管提供(峰值650 nm)，光線集中在葉表均勻地照射在暴露的葉面(4 mm直徑)上。在開(kāi)始的300 μs，每10 μs讀取數(shù)據(jù)一次。隨著熒光動(dòng)力學(xué)信號(hào)變慢，數(shù)據(jù)讀取的時(shí)間間隔變長(zhǎng)。所有測(cè)定都在室溫下進(jìn)行，植株暗適應(yīng)3 h后進(jìn)行測(cè)定。每處理6個(gè)重復(fù)(每個(gè)枝條1個(gè)葉片為1個(gè)重復(fù))，取平均值。
表1 葉綠素?zé)晒?OJIP)參數(shù)及公式
(續(xù)表1)
熒光參數(shù)表示Sm=ECo/RC=Area/(Fm-Fo)電子受體全部還原所需要的能量φPo=TRo/ABS=1-Fo/Fm=Fv/Fm最大量子產(chǎn)量(最大光化學(xué)效率)φEo=ETo/ABS=Fv/Fm×(1-VJ)電子傳遞的量子產(chǎn)額ψEo=ETo/TRo=1-VJ將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA其它電子受體的概率φDo=DIo/ABS=1-φPo=Fo/Fm用于熱耗散的量子比率δRo=REo/ETo=(1-VI)/(1-VJ)電子從還原系統(tǒng)傳遞到PSI電子受體側(cè)的效率φRo=REo/ABS=φPo×ψEo×δRoABS/RCPS I末端受體還原的量子產(chǎn)額TRo/RC單位反應(yīng)中心吸收的光能Fraction of OEC用于還原QA的能量Maximum amplitude of IP phas放氧復(fù)合體IP相增加的最大幅度ETo/RC=(Mo/VJ)×ψEo=(Mo/VJ)×(1-VJ)反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量DIo/RC=ABS/RC-TRo/RC單位反應(yīng)中心耗散的能量ETo/CSo=ABS/CSo×φEo單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額TRo/CSo=ABS/CSo×φPo單位面積捕獲的光能DIo/CSo=ABS/CSo-TRo/CSo單位面積的熱耗散REo/CSo=(REo/ETo)×(ETo/CSo)單位面積PSI電子受體側(cè)的電子還原產(chǎn)額RC/CSo=φPo×(ABS/CSo)×(VJ/Mo)單位面積反應(yīng)中心數(shù)量PIabs=(RC/ABS)×[φPo/(1-φPo)]×[ψo(hù)/(1-ψo(hù))]PSI電子受體側(cè)末端傳遞的電子數(shù)PItot,abs=(RC/ABS)×[φPo/(1-φPo)]×[ψEo/(1-ψEo)]×[δRo/(1-δRo)]總的性能指數(shù)
1.4 數(shù)據(jù)處理分析
采用excel 2003和DPS V6.55版軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用LSD多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 低溫脅迫下新品系OJIP曲線的變化
所有OJIP曲線均呈現(xiàn)典型的多相升起，包含O-J-I-P點(diǎn)。低溫脅迫處理下所有品系的葉片OJIP曲線O點(diǎn)都顯著上升，在P點(diǎn)顯著下降(圖1A，B)，并且低溫對(duì)白雞冠F1代新品系O-J-I-P曲線影響差異較大，其中品系0306D的O點(diǎn)最大(圖1B)，0306I的O點(diǎn)最低；而品系0306F的P點(diǎn)最低，黃棪最高，其它的介于其中。
2.2 低溫脅迫下新品系相對(duì)可變熒光曲線的變化
圖2A、B、C顯示了任一時(shí)間相對(duì)可變熒光變量的OJIP曲線及6個(gè)低溫處理的新品系(種)與正常處理的OJIP曲線之差(ΔVt)。從差異動(dòng)力學(xué)曲線(圖2C)可見(jiàn)：新品系的0306F、0306D的ΔVt曲線變化尤為明顯，變化差異幅度高于其它品種(系)大。其中來(lái)自新品系0306I的ΔVt曲線變化幅度最小(圖2C)。
圖1 低溫脅迫下新品系OJIP曲線的變化Fig.1 Effect of low temperature on average transient chlorophyll a fluorescence(OJIP) of hybrid lines
圖2 低溫脅迫下新品系相對(duì)可變熒光曲線的變化Fig.2 Expressions of relative variable fluorescence of Fo (A) and Fm(B): Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo) and ΔVt(C) on 6replicated low-temp treatment samples and ambient temperature reference
2.3 低溫脅迫下新品系Fo和F300μs之間相對(duì)可變熒光曲線的變化
圖3顯示了Fo和F300μs之間相對(duì)可變熒光變量(WK)的動(dòng)力學(xué)曲線及6個(gè)低溫處理的新品系(品種)與對(duì)照處理(常溫處理)的動(dòng)力學(xué)曲線之差(ΔWK)，從差異動(dòng)力學(xué)曲線可見(jiàn)，新品系0306F與0306D的ΔWK的動(dòng)力學(xué)曲線變化明顯高于其它的品系(種)和黃棪。其中黃棪與0309B變化最為不明顯(圖3C)。
圖3 低溫脅迫下新品系Fo和F300μs之間相對(duì)可變熒光曲線Fig.3 Expressions of relative variable fluorescence of Fo(A) and F300 μs(B): WK=(Ft-Fo)/(F300μs-Fo) and ΔWK(C) on 6replicated low-temp treatment samples and ambient temperature reference
2.4 低溫脅迫下白雞冠F1代新品系ΔFv與Rfd曲線的變化
圖4顯示的是可變熒光的衰減能力ΔFv(Fm-Ft)與可變熒光下降比率Rfd(ΔFv/Ft)的曲線圖。從圖4可看出，低溫下新品系0306F的ΔFv曲線值最低，0306D次之，而黃棪的ΔFv曲線值最大(圖4A)；而Rfd的曲線也是0306F的最低，0306D次之，而黃棪的Rfd曲線值最大(圖4B)。
圖4 低溫脅迫下新品系ΔFv與Rfd曲線的變化Fig.4 Effect of low temperature on average transient Fv and Rfd:ΔFv=(Fm-Ft) (A) and Rfd=ΔFv/Ft(B)
2.5 低溫脅迫下新品系穩(wěn)態(tài)熒光參數(shù)的變化
圖5顯示的是Fo為初始熒光，F(xiàn)m為最大熒光產(chǎn)量，VI與VJ為I與J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光。從圖5可看出，低溫脅迫下6個(gè)品系(種)的Fo、VI都顯著增加(圖5 A、D)，而Fm、VJ顯著下降(圖5B、C)。從圖5A看出，低溫脅迫下Fo以0306D最大，0306I最低(圖5A)；Fm以0306C、0306F最低，黃棪最高(圖5B)。從圖6 D看出，低溫下VI以0306D、0306F最大。
圖5 低溫脅迫下新品系穩(wěn)態(tài)熒光參數(shù)變化Fig.5 Effect of low temperature on steady state fluorescence parameter of F1 hybrids注：每一點(diǎn)為6次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)誤上(下)字母不同者差異顯著(P<0.05)。下同。
2.6 低溫脅迫下新品系葉片單位橫截面的活性參數(shù)變化
從圖6可看出，低溫下各品系除單位面積吸收光能ABS/CSo顯著增加外，其余比活性參數(shù)為：?jiǎn)挝幻娣ePSI電子受體側(cè)的電子還原產(chǎn)額(REo/CSo)、單位面積反應(yīng)中心數(shù)量(RC/CSo)、單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/CSo)、單位面積捕獲的光能(TRo/CSo)、PSI電子受體側(cè)末端傳遞的電子數(shù)(PItot,ABS)都顯著下降。其中低溫下來(lái)自新品系0306D的ABS/CSo最大(圖6 A)，0306F、0306D的REo/CSo、PItot,ABS最小(圖6B、F)，0306F的單位面積捕獲的光能(TRo/CSo)、單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/CSo)最小(圖6D、E)。
圖6 低溫脅迫下新品系葉片單位橫截面的活性參數(shù)變化Fig.6 Effect of low temperature on phenomenological fluxes or activities expressed per excited cross section
2.7 低溫脅迫下新品系葉片單位單位PSⅡ反應(yīng)中心的活性變化
從圖7可看出，低溫下各品系除單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)外，其余參數(shù)反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、用于還原QA的能量(TRo/RC)、IP相最大幅度(IP phase)都下降。其中低溫下0306D、0306F的ABS/RC(圖7A)顯著高于其它品系，0306F的TRo/RC、ETo/RC(圖7B、C)值最低，0306D、0306F的IP phase(IP相最大幅度)(圖7D)也最低。
2.8 低溫脅迫下新品系葉片單位面積熱耗散參數(shù)變化
從圖8可看出，低溫下各品系熱耗散參數(shù)：?jiǎn)挝幻娣e的熱耗散(DIo/CSo)、單位反應(yīng)中心耗散的能量(DIo/RC)、用于熱耗散的量子產(chǎn)額比率(DIo/ABS)都顯著增加。其中低溫下0306D、0306F的DIo/CSo、DIo/ABS、DIo/RC(圖8A、B、C)都顯著大于其它品系，0306I的DIo/CSo、DIo/ABS、DIo/RC(圖8A、B、C)都顯著低于其它品系。ETo/TRo為電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其它電子受體的概率，圖8D顯示低溫下來(lái)自黃棪與0309B的ETo/TRo最大。
2.9 低溫脅迫下新品系葉片量子產(chǎn)額或者分配比例的變化
從圖 9可看出，低溫下各品系的電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/ABS)、PS I末端受體還原的量子產(chǎn)額(REo/ABS)、標(biāo)準(zhǔn)化后OJIP曲線和F=Fm 間的面積或者總的電子載體(Sm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、電子從還原系統(tǒng)傳遞到PS I電子受體側(cè)的效率(REo/ETo)的值都顯著下降，其中低溫下來(lái)自0306F、0306D的ETo/ABS、REo/ABS、Sm、Fv/Fm的值最低(圖9A、B、C、D、F)。低溫下放氧復(fù)合體(OEC)參數(shù)以0306F、0306D為最大(圖9D)。
圖7 低溫脅迫下新品系葉片單位PSⅡ反應(yīng)中心的活性變化Fig.7 Effect of low temperature on specific fluxes or activities expressed per reaction center (RC)
圖8 低溫脅迫下新品系葉片單位面積熱耗散參數(shù)變化Fig.8 Effect of low temperature on energy dissipation
3 討論
目前鑒定植物耐寒性的方法較多，其中應(yīng)用較多、較為準(zhǔn)確的是生理生化數(shù)據(jù)分析。但是該方法樣品篩選耗時(shí)長(zhǎng)，所以評(píng)價(jià)低溫對(duì)植物的影響仍是較為繁瑣的。葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)是利用植物逆境下所發(fā)出的具有豐富光合作用信息熒光信號(hào)，來(lái)判定其其葉片PS II受損傷程度，不具有破壞性，因此成為植物逆境(抗寒性)篩選與鑒定的有效方法之一[23-24]。已經(jīng)在花旗松[5]、玉米[6-7]、長(zhǎng)豇豆[8]、水稻[9]、小麥[19]、西瓜[20]等作物上得到應(yīng)用。
植物在正常生長(zhǎng)的環(huán)境下，葉片所發(fā)射的熒光大部分來(lái)自PS II中的葉綠素a，葉綠素吸收的光能主要有進(jìn)行光合作用、熒光形式發(fā)射耗散以及轉(zhuǎn)變成熱能散失等作用[25-26]，而這三者之間存在此消彼長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，低溫下新品系0306D的Fo增加最大(圖5A)，可能是0306D葉片的PS II反應(yīng)中心出現(xiàn)更為嚴(yán)重失活或不易逆轉(zhuǎn)的破壞，也可能是葉片類囊體膜受到更為嚴(yán)重的損傷。這與茶樹越低濃度鉀處理[27]、越低濃度的磷處理[26]時(shí)Fo增加越大的結(jié)果相一致。本研究還表明，低溫下ΔFv、Rfd以來(lái)自0306F、0306D較其它品系低(圖4A、B)，說(shuō)明可能是0306F、0306D的光合器官受傷害程度較其它品系大。Fv/Fm是PSII反應(yīng)中心的最大光能轉(zhuǎn)換效率，是植物抗寒性的主要敏感指標(biāo)，其值越低可能是光抑制及PSⅡ損害越大。本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫下Fv/Fm來(lái)自0306D、0306F較其它品系低，說(shuō)明可能是0306D、0306F的PS II損害較大。Fv/Fm值降低的程度與該品種的抗冷性之間呈現(xiàn)較好的相關(guān)性[29]，已經(jīng)用于玉米[6]、花旗松[5]、長(zhǎng)豇豆[8]等許多種植物的抗寒性鑒定中。
圖9 低溫脅迫下新品系葉片量子產(chǎn)額或者分配比例的變化Fig.9 Effect of low temperature on yields or flux ratios and derived parameters
典型的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線呈現(xiàn)O、J、I、P相[10]，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的J點(diǎn)、I點(diǎn)和IP相分別與QA、質(zhì)體醌及PS I電子受體側(cè)末端接受體的還原狀態(tài)有關(guān)[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低溫下來(lái)自0306D曲線的O點(diǎn)增加最大(圖1 B)，來(lái)自0306F的P點(diǎn)最低(圖1B)，來(lái)自0306D、0306F的IP相最大幅度下降最大(圖7 D)，意味著PS II的受體側(cè)變得更還原，而PSⅠ的受體側(cè)變得更氧化。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)低溫下來(lái)自0306F、0306D的相對(duì)可變熒光變量(ΔVK、ΔWK)變化幅度較其它品系大(圖2 C，圖3 C)，拐點(diǎn)較為明顯。這在缺氮豇豆[10]、缺磷茶樹[28]、缺鉀茶樹[27]上也有相類似的報(bào)道。
Sm、φEo、ψo(hù)等參數(shù)主要反應(yīng)了PSⅡ受體側(cè)的變化，大豆低溫脅迫下導(dǎo)致φEo、ψo(hù)下降[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低溫下0306F、0306D的Sm較其它品系高(圖9C)，而φEo(圖9A)、ψo(hù)(圖8D)明顯低于其它品系。說(shuō)明0306F、0306D品系最大光化學(xué)效率(φPo)下降較大(圖9D)，同時(shí)，PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞體(Sm)減少最多(圖9C)，從而導(dǎo)致捕獲的光能把電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA-的電子受體概率(φEo)，對(duì)QA-的累積更多。低溫比較敏感品種，電子受體的概率(φEo)的下降更多，使得更多的光能用來(lái)還原QA。
本試驗(yàn)還表明，低溫下0306F、0306D反應(yīng)中心比活性參數(shù)REo/CSo(圖6B)下降較其它品系大、單位反應(yīng)中心吸收的光能ABS/RC(圖7A)增加的較其它品系大，單位面積熱耗散DIo/CSo、DIo/RC、DIo/ABS(圖8A、B、C)顯著增加，較其它品系大。說(shuō)明茶樹各品系低溫脅迫后都啟動(dòng)了相應(yīng)的防御機(jī)制，其中品系0306F、0306D葉片中更多的過(guò)剩激發(fā)能得以及時(shí)耗散，用來(lái)還原QA的激發(fā)能(TRo/RC)，從而更好的消耗掉葉片中過(guò)剩的激發(fā)能。此外，植物吸收過(guò)剩的光能也可能引起1O2和還原性活性氧的產(chǎn)生，對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和光合器產(chǎn)生傷害[31-32]。實(shí)際上已有研究表明，發(fā)生在PSII供體側(cè)和受體側(cè)的光抑制傷害可增加活性氧的產(chǎn)生[33]。性能指數(shù)PItot,ABS反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)[34]，本研究表明，低溫下0306F、0306D的PItot,ABS下降最大(圖6F)，說(shuō)明光合機(jī)構(gòu)受到嚴(yán)重的影響。
總之，研究表明，白雞冠F1代新品系0306F、0306D對(duì)低溫更為敏感。低溫使得0306F、0306D的PSII損傷較其它品系嚴(yán)重，導(dǎo)致整個(gè)電子傳遞鏈嚴(yán)重受阻，還通過(guò)增強(qiáng)能耗散以保護(hù)光合器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生傷害。
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林鄭和，鐘秋生，游小妹，陳志輝，陳常頌，單睿陽(yáng)，阮其春
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)
茶樹原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)[1-2]，喜溫畏寒，對(duì)低溫比較敏感。近幾年全球氣溫變化不穩(wěn)定，而且茶葉消費(fèi)區(qū)域不斷擴(kuò)大，茶園種植面積不斷增多[3]，種植緯度北移。低溫凍害在我國(guó)茶樹栽培中易發(fā)常見(jiàn)，在南方地區(qū)(如廣東、福建、浙江等地)特別是倒春寒對(duì)茶葉的生產(chǎn)及其經(jīng)濟(jì)效益影響巨大。由于茶樹為多年生木本植物，選育一個(gè)良種周期較長(zhǎng)，主要是新種質(zhì)創(chuàng)制、早期的鑒定與開(kāi)發(fā)利用速度緩慢，以致新品種培育工作滯后。以往茶樹抗寒性的鑒定通常通過(guò)生化指標(biāo)的測(cè)定[3-4]，但步驟比較繁瑣。植物葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)是近年來(lái)新興的檢測(cè)植物光合作用生理狀況的技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在植物抗冷性、抗凍性方面也顯示出良好的應(yīng)用前景，已經(jīng)在花旗松[5]、玉米[6-7]、長(zhǎng)豇豆[8]、水稻[9-10]等作物上得到應(yīng)用。
典型的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線呈現(xiàn)O、J、I、P相[11]。有研究表明，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線是反映光合電子傳遞靈敏指標(biāo)及子傳遞的還原[12-13]。研究表明，OJ相反映了PSII受體側(cè)的還原[11,13]；JI相反映了PQ庫(kù)的還原[11,14]；IP相反映了PSI受體側(cè)還原的部分，被認(rèn)為是PSII受體側(cè)還原最后的限制速度的一步，其幅度可做為PSI含量的粗略指標(biāo)[15]。植物逆境下(低溫脅迫)葉片光合速率下降，并引起光能過(guò)剩，甚至導(dǎo)致光抑制的發(fā)生及光合機(jī)構(gòu)被破壞[15-16]。低溫敏感型番茄葉片在低溫下顯著影響PSⅡ反應(yīng)中心和電子傳遞，顯著降低了PSⅡ的活性，而對(duì)耐低溫野生番茄PSⅡ活性影響較小[17]。廣玉蘭[18]、小麥[19]等植物在低溫下也得出了類似的結(jié)果。低溫下冷敏感品種的西瓜[22]、水稻[23]反應(yīng)中心、天線系統(tǒng)、光合機(jī)構(gòu)受到傷害較耐冷品種嚴(yán)重，然而也有人研究發(fā)現(xiàn)[22]，低溫下各不結(jié)球白菜品系光化學(xué)效率的差異與電子傳遞的有效性是各品系抗冷性能差異的主要原因之一。Perks等[5]用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)檢測(cè)花旗松的凍害情況時(shí)，F(xiàn)v/Fm變化與針葉的傷害和存活率呈線性關(guān)系。也有人認(rèn)為，葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm與電解質(zhì)滲透率呈負(fù)相關(guān)，這也可作為鑒定植物抗寒性強(qiáng)弱的另一個(gè)指標(biāo)[11,15]。
‘白雞冠’為武夷山四大名叢之一，其F1代芽葉奇特，葉色淡綠，葉質(zhì)較脆，綠中帶白，茶葉顏色與眾不同，但抗寒性較差。有鑒于此，本文利用葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)白雞冠的F1代新品系進(jìn)行抗寒性篩選鑒定，為茶樹抗寒育種的早期鑒定提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)于2015～2016年在福建農(nóng)林大學(xué)資環(huán)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)選用5個(gè)白雞冠雜交創(chuàng)新種質(zhì)F1代0306F、0306I、0309B、0306C、0306D及黃棪(抗寒、抗旱都較強(qiáng))，每品種(系)選取生長(zhǎng)高度、長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲害的扦插苗(10月齡)。
1.2 低溫脅迫方法
將植株葉片用去離子水沖洗、擦凈后，用聚乙烯保鮮膜包裹。將每個(gè)品種(系)分為2組，放入智能人工氣候箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)中，一組放置在正常溫度(28℃)下生長(zhǎng)，另一組進(jìn)行低溫(0℃)脅迫處理，兩組光照強(qiáng)度和光照時(shí)間都相同，分別為300 μmol·m-2·s-1和12 h·d-1。
1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定
用英國(guó)生產(chǎn)的連續(xù)激發(fā)式葉綠素?zé)晒鈨x(Hansatech Handy PEA Hansatech Instruments Limited，Norfolk，UK)。OJIP曲線是由3400 μmol·m-2·s-1的紅光誘導(dǎo)的，紅光由3個(gè)發(fā)光二極管提供(峰值650 nm)，光線集中在葉表均勻地照射在暴露的葉面(4 mm直徑)上。在開(kāi)始的300 μs，每10 μs讀取數(shù)據(jù)一次。隨著熒光動(dòng)力學(xué)信號(hào)變慢，數(shù)據(jù)讀取的時(shí)間間隔變長(zhǎng)。所有測(cè)定都在室溫下進(jìn)行，植株暗適應(yīng)3 h后進(jìn)行測(cè)定。每處理6個(gè)重復(fù)(每個(gè)枝條1個(gè)葉片為1個(gè)重復(fù))，取平均值。
表1 葉綠素?zé)晒?OJIP)參數(shù)及公式
(續(xù)表1)
熒光參數(shù)表示Sm=ECo/RC=Area/(Fm-Fo)電子受體全部還原所需要的能量φPo=TRo/ABS=1-Fo/Fm=Fv/Fm最大量子產(chǎn)量(最大光化學(xué)效率)φEo=ETo/ABS=Fv/Fm×(1-VJ)電子傳遞的量子產(chǎn)額ψEo=ETo/TRo=1-VJ將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA其它電子受體的概率φDo=DIo/ABS=1-φPo=Fo/Fm用于熱耗散的量子比率δRo=REo/ETo=(1-VI)/(1-VJ)電子從還原系統(tǒng)傳遞到PSI電子受體側(cè)的效率φRo=REo/ABS=φPo×ψEo×δRoABS/RCPS I末端受體還原的量子產(chǎn)額TRo/RC單位反應(yīng)中心吸收的光能Fraction of OEC用于還原QA的能量Maximum amplitude of IP phas放氧復(fù)合體IP相增加的最大幅度ETo/RC=(Mo/VJ)×ψEo=(Mo/VJ)×(1-VJ)反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量DIo/RC=ABS/RC-TRo/RC單位反應(yīng)中心耗散的能量ETo/CSo=ABS/CSo×φEo單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額TRo/CSo=ABS/CSo×φPo單位面積捕獲的光能DIo/CSo=ABS/CSo-TRo/CSo單位面積的熱耗散REo/CSo=(REo/ETo)×(ETo/CSo)單位面積PSI電子受體側(cè)的電子還原產(chǎn)額RC/CSo=φPo×(ABS/CSo)×(VJ/Mo)單位面積反應(yīng)中心數(shù)量PIabs=(RC/ABS)×[φPo/(1-φPo)]×[ψo(hù)/(1-ψo(hù))]PSI電子受體側(cè)末端傳遞的電子數(shù)PItot,abs=(RC/ABS)×[φPo/(1-φPo)]×[ψEo/(1-ψEo)]×[δRo/(1-δRo)]總的性能指數(shù)
1.4 數(shù)據(jù)處理分析
采用excel 2003和DPS V6.55版軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用LSD多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 低溫脅迫下新品系OJIP曲線的變化
所有OJIP曲線均呈現(xiàn)典型的多相升起，包含O-J-I-P點(diǎn)。低溫脅迫處理下所有品系的葉片OJIP曲線O點(diǎn)都顯著上升，在P點(diǎn)顯著下降(圖1A，B)，并且低溫對(duì)白雞冠F1代新品系O-J-I-P曲線影響差異較大，其中品系0306D的O點(diǎn)最大(圖1B)，0306I的O點(diǎn)最低；而品系0306F的P點(diǎn)最低，黃棪最高，其它的介于其中。
2.2 低溫脅迫下新品系相對(duì)可變熒光曲線的變化
圖2A、B、C顯示了任一時(shí)間相對(duì)可變熒光變量的OJIP曲線及6個(gè)低溫處理的新品系(種)與正常處理的OJIP曲線之差(ΔVt)。從差異動(dòng)力學(xué)曲線(圖2C)可見(jiàn)：新品系的0306F、0306D的ΔVt曲線變化尤為明顯，變化差異幅度高于其它品種(系)大。其中來(lái)自新品系0306I的ΔVt曲線變化幅度最小(圖2C)。
圖1 低溫脅迫下新品系OJIP曲線的變化Fig.1 Effect of low temperature on average transient chlorophyll a fluorescence(OJIP) of hybrid lines
圖2 低溫脅迫下新品系相對(duì)可變熒光曲線的變化Fig.2 Expressions of relative variable fluorescence of Fo (A) and Fm(B): Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo) and ΔVt(C) on 6replicated low-temp treatment samples and ambient temperature reference
2.3 低溫脅迫下新品系Fo和F300μs之間相對(duì)可變熒光曲線的變化
圖3顯示了Fo和F300μs之間相對(duì)可變熒光變量(WK)的動(dòng)力學(xué)曲線及6個(gè)低溫處理的新品系(品種)與對(duì)照處理(常溫處理)的動(dòng)力學(xué)曲線之差(ΔWK)，從差異動(dòng)力學(xué)曲線可見(jiàn)，新品系0306F與0306D的ΔWK的動(dòng)力學(xué)曲線變化明顯高于其它的品系(種)和黃棪。其中黃棪與0309B變化最為不明顯(圖3C)。
圖3 低溫脅迫下新品系Fo和F300μs之間相對(duì)可變熒光曲線Fig.3 Expressions of relative variable fluorescence of Fo(A) and F300 μs(B): WK=(Ft-Fo)/(F300μs-Fo) and ΔWK(C) on 6replicated low-temp treatment samples and ambient temperature reference
2.4 低溫脅迫下白雞冠F1代新品系ΔFv與Rfd曲線的變化
圖4顯示的是可變熒光的衰減能力ΔFv(Fm-Ft)與可變熒光下降比率Rfd(ΔFv/Ft)的曲線圖。從圖4可看出，低溫下新品系0306F的ΔFv曲線值最低，0306D次之，而黃棪的ΔFv曲線值最大(圖4A)；而Rfd的曲線也是0306F的最低，0306D次之，而黃棪的Rfd曲線值最大(圖4B)。
圖4 低溫脅迫下新品系ΔFv與Rfd曲線的變化Fig.4 Effect of low temperature on average transient Fv and Rfd:ΔFv=(Fm-Ft) (A) and Rfd=ΔFv/Ft(B)
2.5 低溫脅迫下新品系穩(wěn)態(tài)熒光參數(shù)的變化
圖5顯示的是Fo為初始熒光，F(xiàn)m為最大熒光產(chǎn)量，VI與VJ為I與J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光。從圖5可看出，低溫脅迫下6個(gè)品系(種)的Fo、VI都顯著增加(圖5 A、D)，而Fm、VJ顯著下降(圖5B、C)。從圖5A看出，低溫脅迫下Fo以0306D最大，0306I最低(圖5A)；Fm以0306C、0306F最低，黃棪最高(圖5B)。從圖6 D看出，低溫下VI以0306D、0306F最大。
圖5 低溫脅迫下新品系穩(wěn)態(tài)熒光參數(shù)變化Fig.5 Effect of low temperature on steady state fluorescence parameter of F1 hybrids注：每一點(diǎn)為6次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)誤上(下)字母不同者差異顯著(P<0.05)。下同。
2.6 低溫脅迫下新品系葉片單位橫截面的活性參數(shù)變化
從圖6可看出，低溫下各品系除單位面積吸收光能ABS/CSo顯著增加外，其余比活性參數(shù)為：?jiǎn)挝幻娣ePSI電子受體側(cè)的電子還原產(chǎn)額(REo/CSo)、單位面積反應(yīng)中心數(shù)量(RC/CSo)、單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/CSo)、單位面積捕獲的光能(TRo/CSo)、PSI電子受體側(cè)末端傳遞的電子數(shù)(PItot,ABS)都顯著下降。其中低溫下來(lái)自新品系0306D的ABS/CSo最大(圖6 A)，0306F、0306D的REo/CSo、PItot,ABS最小(圖6B、F)，0306F的單位面積捕獲的光能(TRo/CSo)、單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/CSo)最小(圖6D、E)。
圖6 低溫脅迫下新品系葉片單位橫截面的活性參數(shù)變化Fig.6 Effect of low temperature on phenomenological fluxes or activities expressed per excited cross section
2.7 低溫脅迫下新品系葉片單位單位PSⅡ反應(yīng)中心的活性變化
從圖7可看出，低溫下各品系除單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)外，其余參數(shù)反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、用于還原QA的能量(TRo/RC)、IP相最大幅度(IP phase)都下降。其中低溫下0306D、0306F的ABS/RC(圖7A)顯著高于其它品系，0306F的TRo/RC、ETo/RC(圖7B、C)值最低，0306D、0306F的IP phase(IP相最大幅度)(圖7D)也最低。
2.8 低溫脅迫下新品系葉片單位面積熱耗散參數(shù)變化
從圖8可看出，低溫下各品系熱耗散參數(shù)：?jiǎn)挝幻娣e的熱耗散(DIo/CSo)、單位反應(yīng)中心耗散的能量(DIo/RC)、用于熱耗散的量子產(chǎn)額比率(DIo/ABS)都顯著增加。其中低溫下0306D、0306F的DIo/CSo、DIo/ABS、DIo/RC(圖8A、B、C)都顯著大于其它品系，0306I的DIo/CSo、DIo/ABS、DIo/RC(圖8A、B、C)都顯著低于其它品系。ETo/TRo為電子傳遞鏈中超過(guò)QA的其它電子受體的概率，圖8D顯示低溫下來(lái)自黃棪與0309B的ETo/TRo最大。
2.9 低溫脅迫下新品系葉片量子產(chǎn)額或者分配比例的變化
從圖 9可看出，低溫下各品系的電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETo/ABS)、PS I末端受體還原的量子產(chǎn)額(REo/ABS)、標(biāo)準(zhǔn)化后OJIP曲線和F=Fm 間的面積或者總的電子載體(Sm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、電子從還原系統(tǒng)傳遞到PS I電子受體側(cè)的效率(REo/ETo)的值都顯著下降，其中低溫下來(lái)自0306F、0306D的ETo/ABS、REo/ABS、Sm、Fv/Fm的值最低(圖9A、B、C、D、F)。低溫下放氧復(fù)合體(OEC)參數(shù)以0306F、0306D為最大(圖9D)。
圖7 低溫脅迫下新品系葉片單位PSⅡ反應(yīng)中心的活性變化Fig.7 Effect of low temperature on specific fluxes or activities expressed per reaction center (RC)
圖8 低溫脅迫下新品系葉片單位面積熱耗散參數(shù)變化Fig.8 Effect of low temperature on energy dissipation
3 討論
目前鑒定植物耐寒性的方法較多，其中應(yīng)用較多、較為準(zhǔn)確的是生理生化數(shù)據(jù)分析。但是該方法樣品篩選耗時(shí)長(zhǎng)，所以評(píng)價(jià)低溫對(duì)植物的影響仍是較為繁瑣的。葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)是利用植物逆境下所發(fā)出的具有豐富光合作用信息熒光信號(hào)，來(lái)判定其其葉片PS II受損傷程度，不具有破壞性，因此成為植物逆境(抗寒性)篩選與鑒定的有效方法之一[23-24]。已經(jīng)在花旗松[5]、玉米[6-7]、長(zhǎng)豇豆[8]、水稻[9]、小麥[19]、西瓜[20]等作物上得到應(yīng)用。
植物在正常生長(zhǎng)的環(huán)境下，葉片所發(fā)射的熒光大部分來(lái)自PS II中的葉綠素a，葉綠素吸收的光能主要有進(jìn)行光合作用、熒光形式發(fā)射耗散以及轉(zhuǎn)變成熱能散失等作用[25-26]，而這三者之間存在此消彼長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，低溫下新品系0306D的Fo增加最大(圖5A)，可能是0306D葉片的PS II反應(yīng)中心出現(xiàn)更為嚴(yán)重失活或不易逆轉(zhuǎn)的破壞，也可能是葉片類囊體膜受到更為嚴(yán)重的損傷。這與茶樹越低濃度鉀處理[27]、越低濃度的磷處理[26]時(shí)Fo增加越大的結(jié)果相一致。本研究還表明，低溫下ΔFv、Rfd以來(lái)自0306F、0306D較其它品系低(圖4A、B)，說(shuō)明可能是0306F、0306D的光合器官受傷害程度較其它品系大。Fv/Fm是PSII反應(yīng)中心的最大光能轉(zhuǎn)換效率，是植物抗寒性的主要敏感指標(biāo)，其值越低可能是光抑制及PSⅡ損害越大。本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫下Fv/Fm來(lái)自0306D、0306F較其它品系低，說(shuō)明可能是0306D、0306F的PS II損害較大。Fv/Fm值降低的程度與該品種的抗冷性之間呈現(xiàn)較好的相關(guān)性[29]，已經(jīng)用于玉米[6]、花旗松[5]、長(zhǎng)豇豆[8]等許多種植物的抗寒性鑒定中。
圖9 低溫脅迫下新品系葉片量子產(chǎn)額或者分配比例的變化Fig.9 Effect of low temperature on yields or flux ratios and derived parameters
典型的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線呈現(xiàn)O、J、I、P相[10]，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的J點(diǎn)、I點(diǎn)和IP相分別與QA、質(zhì)體醌及PS I電子受體側(cè)末端接受體的還原狀態(tài)有關(guān)[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低溫下來(lái)自0306D曲線的O點(diǎn)增加最大(圖1 B)，來(lái)自0306F的P點(diǎn)最低(圖1B)，來(lái)自0306D、0306F的IP相最大幅度下降最大(圖7 D)，意味著PS II的受體側(cè)變得更還原，而PSⅠ的受體側(cè)變得更氧化。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)低溫下來(lái)自0306F、0306D的相對(duì)可變熒光變量(ΔVK、ΔWK)變化幅度較其它品系大(圖2 C，圖3 C)，拐點(diǎn)較為明顯。這在缺氮豇豆[10]、缺磷茶樹[28]、缺鉀茶樹[27]上也有相類似的報(bào)道。
Sm、φEo、ψo(hù)等參數(shù)主要反應(yīng)了PSⅡ受體側(cè)的變化，大豆低溫脅迫下導(dǎo)致φEo、ψo(hù)下降[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低溫下0306F、0306D的Sm較其它品系高(圖9C)，而φEo(圖9A)、ψo(hù)(圖8D)明顯低于其它品系。說(shuō)明0306F、0306D品系最大光化學(xué)效率(φPo)下降較大(圖9D)，同時(shí)，PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞體(Sm)減少最多(圖9C)，從而導(dǎo)致捕獲的光能把電子傳遞到電子傳遞鏈中超過(guò)QA-的電子受體概率(φEo)，對(duì)QA-的累積更多。低溫比較敏感品種，電子受體的概率(φEo)的下降更多，使得更多的光能用來(lái)還原QA。
本試驗(yàn)還表明，低溫下0306F、0306D反應(yīng)中心比活性參數(shù)REo/CSo(圖6B)下降較其它品系大、單位反應(yīng)中心吸收的光能ABS/RC(圖7A)增加的較其它品系大，單位面積熱耗散DIo/CSo、DIo/RC、DIo/ABS(圖8A、B、C)顯著增加，較其它品系大。說(shuō)明茶樹各品系低溫脅迫后都啟動(dòng)了相應(yīng)的防御機(jī)制，其中品系0306F、0306D葉片中更多的過(guò)剩激發(fā)能得以及時(shí)耗散，用來(lái)還原QA的激發(fā)能(TRo/RC)，從而更好的消耗掉葉片中過(guò)剩的激發(fā)能。此外，植物吸收過(guò)剩的光能也可能引起1O2和還原性活性氧的產(chǎn)生，對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和光合器產(chǎn)生傷害[31-32]。實(shí)際上已有研究表明，發(fā)生在PSII供體側(cè)和受體側(cè)的光抑制傷害可增加活性氧的產(chǎn)生[33]。性能指數(shù)PItot,ABS反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)[34]，本研究表明，低溫下0306F、0306D的PItot,ABS下降最大(圖6F)，說(shuō)明光合機(jī)構(gòu)受到嚴(yán)重的影響。
總之，研究表明，白雞冠F1代新品系0306F、0306D對(duì)低溫更為敏感。低溫使得0306F、0306D的PSII損傷較其它品系嚴(yán)重，導(dǎo)致整個(gè)電子傳遞鏈嚴(yán)重受阻，還通過(guò)增強(qiáng)能耗散以保護(hù)光合器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生傷害。
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