熊鳳嬌，馬儷珍,*，王 洋

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，天津市水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全校企協(xié)同創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

亞硝酸鹽作為一種重要的添加劑，被廣泛用于肉及肉制品的加工過程中。亞硝酸鹽的添加不僅可以提高肉制品的風(fēng)味和色澤[1-2]，還能起到抑菌、抗氧化的作用[3-4]。但是亞硝酸鹽能夠?yàn)閬喯趸磻?yīng)提供亞硝化劑，亞硝化劑可以與肉制品中存在的二級(jí)胺類物質(zhì)反應(yīng)生成致癌物N-亞硝胺。N-亞硝胺種類很多，有揮發(fā)性亞硝胺（包括N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基吡咯烷等）和非揮發(fā)性亞硝胺（包括N-亞硝基脯氨酸、N-亞硝基羥脯氨酸），其中NDMA是目前研究表明致癌性最強(qiáng)的一種亞硝胺物質(zhì)[5]。控制N-亞硝胺的方法主要有以下幾種：找出亞硝酸鹽的替代物；使用亞硝化抑制劑來阻斷N-亞硝胺的形成；分解肉制品中已經(jīng)生成的N-亞硝胺。至今尚未找到一種可以完全替代亞硝酸鹽的物質(zhì)，因此對(duì)于降低肉制品中N-亞硝胺的方法，目前研究較多的是找出亞硝化抑制劑來阻斷N-亞硝胺的形成或分解產(chǎn)品中已經(jīng)形成的N-亞硝基類化合物。

食品抗氧化劑是一類可以減緩食品氧化，提高食品貯藏期的食品添加劑。研究發(fā)現(xiàn)，多種食品抗氧化劑具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽和自由基的能力，因此可以作為亞硝化抑制劑阻斷肉制品中N-亞硝胺的形成。VC是一種常見的天然抗氧化劑，可以有效清除肉制品中的亞硝酸鹽[6]；VE是一種脂溶性抗氧化劑，可以延緩油脂氧化，具有一定的清除亞硝酸鹽的能力[7]；除了VC和VE外，一些多酚類物質(zhì)，例如茶多酚等對(duì)亞硝酸鹽也有一定的清除作用[8]。迷迭香作為一種天然抗氧化劑被廣泛用于肉制品的貯藏加工中，其主要通過清除自由基達(dá)到抗氧化的效果。將不同抗氧化劑結(jié)合使用時(shí)，可以有效發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化效果。梁云[9]模擬了一項(xiàng)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，將VC與VE同時(shí)添加至菜油中，結(jié)果表明，處理后8 d油脂的過氧化值較單獨(dú)使用VC降低26%。此外，VE的存在可以有效提高VC的抗氧化活性及脂溶性自由基的清除能力[10-12]。陳家玉[13]研究發(fā)現(xiàn)，將迷迭香和沒食子酸復(fù)配使用，其抗氧化效果明顯優(yōu)于單一抗氧化劑。

二次回歸正交試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)是正交設(shè)計(jì)的一種，它可以分析多種試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，也能夠建立多元二次回歸方程，屬更高級(jí)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)技術(shù)[14]。有關(guān)體外模擬體系亞硝化反應(yīng)的研究中，學(xué)者們多以水相體系作為研究對(duì)象[15-16]，但考慮到實(shí)際的肉糜體系是含有一定脂肪的乳化體系，因此本研究在含有20%油脂的亞硝化體系中添加不同比例的亞硝化抑制劑（茶多酚、迷迭香、VE、VC），采用四因子二次回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選阻斷NDMA形成的抑制劑最佳配比，并將根據(jù)方程預(yù)測到的最佳亞硝化抑制劑應(yīng)用到魚糜制品（魚豆腐）中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍魚糜（帶魚） 青島佰騰國際貿(mào)易有限公司；大豆蛋白粉 河南盛之得商貿(mào)有限公司；變性淀粉 濟(jì)南希諾機(jī)械有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase，TGase） 四川吉晟生物醫(yī)藥有限公司；花生油、食鹽、白砂糖、大蒜、豬背膘、雞小胸、雞皮 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、NaOH、二甲基鹽酸鹽（DMA·HCl）、乳化劑（PEG 8000）、二氯甲烷（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；VC、VE上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；NDMA（色譜純） 美國AccuStandard公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；ST 40R離心機(jī)美國Thermo公司；18Basic勻漿機(jī) 德國IKA公司；STARTER3100酸度計(jì) 美國Ohaus公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外亞硝化模擬乳化體系的制備

參照Kuniyuki等[17]的方法，采用體外模擬條件及亞硝化反應(yīng)體系，用25 mmol/L、pH值為6.2的磷酸緩沖鹽配制50 mmol/L NaNO2和25 mmol/L的二級(jí)胺鹽酸鹽母液。首先在50 mL離心管中加入一定量的NaNO2和二級(jí)胺鹽酸鹽溶液，使二者在體系中的終濃度分別為20、10 mmol/L，然后在體系中加入花生油（20%），再將不同配比的亞硝化抑制劑加入模擬體系中，最后加入0.05%乳化劑（PEG 8000）制備乳化體系，同時(shí)做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組中NDMA底物濃度及油脂添加比例等與實(shí)驗(yàn)組保持一致，但不添加亞硝化抑制劑。將制備的亞硝化體系于70 ℃條件下水浴1 h完成亞硝化反應(yīng)過程，反應(yīng)終點(diǎn)即用6 mmol/L的NaOH溶液將反應(yīng)體系的pH值調(diào)至13，以終止亞硝化反應(yīng)。然后向離心管中加入5 mL二氯甲烷，充分振蕩2 min，離心5 min（4 ℃，10 000×g），吸取下層清亮部分，過0.45 μm有機(jī)濾膜后裝入氣相色譜儀的樣品瓶中，待上機(jī)測定。

1.3.2 二次回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定以茶多酚質(zhì)量濃度（x1，40～80 mg/L）、迷迭香質(zhì)量濃度（x2，40～80 mg/L）、VE質(zhì)量濃度（x3，40～80 mg/L）和VC質(zhì)量濃度（x4，40～80 mg/L）為影響因素，進(jìn)行二次回歸正交組合試驗(yàn)。將Z1、Z2、Z3、Z4代入原編碼水平，即由于因素?cái)?shù)P=4，二水平試驗(yàn)次數(shù)mc=16，零水平試驗(yàn)次數(shù)m0=3[18]，根據(jù)γ2的計(jì)算公式可得γ＝1.546。因素水平編碼如表1所示。

表 1 因素水平編碼表Table 1 Code levels and corresponding actual levels of independent variables

1.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 體外亞硝化模擬乳化體系中的驗(yàn)證

按照1.3.1節(jié)的方法，將二次回歸正交組合設(shè)計(jì)得出的最佳配比亞硝化抑制劑添加到體外亞硝化模擬乳化體系中，設(shè)置6 組重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3.2 魚豆腐中的驗(yàn)證

魚豆腐的制備：魚豆腐的制作工藝及其各種原料配比參考熊鳳嬌等[19]的方法。在斬拌機(jī)中先放入微凍狀態(tài)的冷凍帶魚魚糜，慢速斬拌，再加入雞小胸肉高速斬拌均勻，依次加入復(fù)合磷酸鹽、食鹽、乳化漿、大蒜瓣、小料、乳化肥膘和變性淀粉，繼續(xù)斬拌至肉餡細(xì)膩均勻，期間加入碎冰，斬拌全過程以及終點(diǎn)溫度控制在10 ℃以內(nèi)。將制備好的肉餡平鋪在蒸籠中，蒸15 min成型，將成型后的肉糜冷卻切塊，于油鍋中炸3～4 min（大豆油，油溫130～140 ℃），至魚豆腐表面微黃即可。

將由二次回歸正交組合設(shè)計(jì)得出的最佳配比亞硝化抑制劑應(yīng)用到魚豆腐的實(shí)際生產(chǎn)中，分析亞硝化抑制劑的加入對(duì)魚豆腐中NDMA的抑制效果，同時(shí)做對(duì)照實(shí)驗(yàn)（魚豆腐對(duì)照組除了不加亞硝化抑制劑外，其余的原料添加比例與實(shí)驗(yàn)組保持一致），進(jìn)一步驗(yàn)證組合設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 NDMA的測定

參照GB/T 5009.26—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺化合物的測定》[20]，使用氣相色譜儀測定魚豆腐中的N-亞硝胺。

將前處理好的樣品瓶上氣相色譜儀測定，測定條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度330 ℃；載氣流速6 mL/min；空氣流速60 mL/min；H2流速3 mL/min；分流模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。利用安捷倫工作站對(duì)色譜圖進(jìn)行分析及數(shù)據(jù)處理，采用保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。

1.3.5 NDMA抑制率的計(jì)算

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本運(yùn)算，使用Origin 9.0軟件作圖。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次回歸正交試驗(yàn)

2.1.1 二次回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

二次回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表 2 二次回歸正交組合設(shè)計(jì)正交表及結(jié)果Table 2 Quadratic orthogonal regression design with response variable

2.1.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

2.1.2.1 擬合度檢驗(yàn)

總平方和SST=584.269，其中fT=n－1=26，回歸平方和U=474.739，fU=11，剩余平方和Qe2=SSTU=1 0 9.5 3 0，fe2=1 5，均方說明此回歸方程的擬合度檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平。

2.1.2.2 偏回歸系數(shù)檢驗(yàn)

表 3 回歸方程與偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of the regression equation and partial regression coefficients

由表3可知，偏回歸系數(shù)b1、b2、b1’、b2’、b3’、b4’達(dá)到顯著或極顯著水平，雖然b12在0.05水平上不顯著，但在0.25水平上是顯著的，故不予剔除。在剔除不顯著項(xiàng)后，簡化的回歸方程為：

y＝38.814－1.342Z1－1.417Z2+0.969Z1Z2－2.348Z1’－2.690Z2’－2.035Z3’－3.700Z4’ （1）

將方程（1）轉(zhuǎn)化為用自然變量表示的回歸方程：

2.1.2.3 回歸方程的失擬性檢驗(yàn)

誤差平方和Qe由零水平試驗(yàn)結(jié)果Y01、Y02及Y03獲得：Qe=3.046，fe=3－1=2，擬合度檢驗(yàn)為：失擬檢驗(yàn)差異不顯著，說明該方程擬合的很好。

試驗(yàn)結(jié)果表明擬和檢驗(yàn)差異顯著，失擬檢驗(yàn)差異不顯著。擬合檢驗(yàn)差異顯著，說明此回歸模型所考慮因素足以反映試驗(yàn)中亞硝化抑制劑的添加對(duì)NDMA抑制率有影響，失擬檢驗(yàn)差異不顯著，說明此回歸方程在此試驗(yàn)中有一定意義。由于數(shù)據(jù)進(jìn)行了中心標(biāo)準(zhǔn)化，消除了量綱上的差異，可以直接從回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小來分析各亞硝化抑制劑對(duì)NDMA抑制效果的影響。

由回歸方程（1）可知，各回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小依次為b2＞b1＞b3＞b4，說明迷迭香和茶多酚對(duì)NDMA的抑制效果較好。邢必亮[21]研究茶多酚的添加對(duì)腌肉中NDMA殘留量的影響，結(jié)果表明，一定濃度茶多酚的添加可以有效降低腌制肉制品中NDMA的含量，與本研究結(jié)果一致。茶多酚抑制NDMA形成的原因可能是茶多酚可以與硝酸發(fā)生反應(yīng)，生成硝基化合物[22-24]。在本研究的模擬體系中，作為反應(yīng)底物之一的亞硝酸鹽可以在酸性條件下經(jīng)過系列反應(yīng)生成硝酸，硝酸可以進(jìn)一步分解成氮氧化物亞硝化二級(jí)胺類物質(zhì)，生成N-亞硝胺。因此茶多酚可能通過消耗NDMA的前體物質(zhì)硝酸從而達(dá)到抑制NDMA的效果。

由表3可知，對(duì)各偏回歸系數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，偏回歸系數(shù)Z1、Z2、Z1’、Z2’、Z3’、Z4’對(duì)應(yīng)的P值小于0.05，因此因素x1、x2、x11、x22、x33、x44對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著影響。

2.1.3 單因素效應(yīng)分析

在單因素效應(yīng)分析中，將得到的回歸方程（1）的4 個(gè)因素中任意3 個(gè)固定在零水平，分別描述單個(gè)因素的變動(dòng)對(duì)模擬體系中NDMA抑制率的影響[25-27]。茶多酚、迷迭香、VE、VC 4 個(gè)因素的單因素效應(yīng)方程如下：Y1=38.814－1.343Z1－2.348Z12、Y2=38.814－1.417Z2－2.690Z2

2、Y3=38.814－0.707Z3－2.035Z32、Y4=38.814－0.637Z4－3.700Z42。

把4 個(gè)因素的取值固定在－1.546、－1、0、1、1.546水平，根據(jù)上述方程，計(jì)算出各因素在5 個(gè)不同水平上對(duì)NDMA的抑制率，并以此作圖。

圖1 各單因素與NDMA抑制率的關(guān)系Fig. 1 Relationship between each factors and inhibition rate of NDMA

由圖1可知，各因子處于－1.546～1.546這一水平區(qū)間時(shí)，4 個(gè)影響因素與NDMA抑制率的關(guān)系曲線呈拋物線狀，表明這4 個(gè)因素不能無限制的升高，超過一定范圍便會(huì)使NDMA的抑制率降低。茶多酚（x1）、迷迭香（x2）、VE（x3）和VC（x4）4 種亞硝化抑制劑在－1.546≤Z≤0編碼范圍內(nèi)時(shí)，NDMA抑制率隨著編碼值的增加而增加；而在0≤Z≤1.546編碼范圍內(nèi)，編碼值與NDMA抑制率呈負(fù)相關(guān)，模擬體系中NDMA抑制率隨著編碼值的增加呈下降趨勢；4 種因素均在編碼值為0時(shí)NDMA抑制率有最大值。

2.1.4 因素間交互效應(yīng)分析

由表3可知，對(duì)回歸方程偏回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，b12在α=0.25水平上有顯著性差異，表示x1（茶多酚）與x2（迷迭香）之間存在交互作用，但交互作用不顯著（P＜0.05），其他因素之間的交互作用均不顯著。

2.1.5 邊際效應(yīng)分析

將單因子效應(yīng)方程本身求一階偏導(dǎo)數(shù)，得到單因子的邊際效應(yīng)方程：dY/dx1=－1.343－4.696Z1、dY/dx2=－1.417－5.380Z2、dY/dx3=－0.707－4.070Z3、dY/dx4=－0.637－7.400Z4。

單因素邊際效應(yīng)方程反映了Y值隨單個(gè)因素水平變化而變化的速率。利用邊際效應(yīng)方程繪制邊際效應(yīng)圖。

圖2 邊際效應(yīng)值分析Fig. 2 Boundry effect curve of each factor

由圖2可知：4 種因素在－1.546≤Z＜0（40≤x＜60）編碼值范圍內(nèi)，Y值隨著編碼值的增加有上升的趨勢，與編碼值呈現(xiàn)正相關(guān)，且上升的速率隨著編碼水平的增加有所下降；在0＜Z≤1.546（60≤x＜80）編碼范圍內(nèi)，4 種因素的Y值隨著編碼值的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，而且下降的速率隨著編碼水平的增加逐漸增加[28-30]。

2.2 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

利用數(shù)學(xué)求極值的方法，對(duì)回歸方程（1）求一階偏導(dǎo)數(shù)，用Excel解方程組得，當(dāng)Z1=0.010 558、Z2=0.008 478、Z3=0、Z4=0時(shí)，Y有極大值，各因素x1=60.14、x2=60.11、x3=60.00、x4=60.00，即茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L時(shí)，可以得到理論上最高的NDMA抑制率。在此亞硝化抑制劑的添加量下，由回歸方程計(jì)算出的NDMA抑制率預(yù)測值為47.16%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在模擬體系中添加茶多酚、迷迭香、VE和VC，添加量分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L，結(jié)果表明，抑制劑的添加可以抑制模擬體系中45.32%的NDMA；同時(shí)將相同水平的亞硝化抑制劑添加到魚豆腐的實(shí)際生產(chǎn)中，分析亞硝化抑制劑對(duì)魚豆腐中NDMA抑制率的影響，結(jié)果表明，亞硝化抑制劑的添加可以明顯抑制魚豆腐中NDMA的形成，NDMA抑制率可達(dá)44.00%（對(duì)照組中NDMA含量為6.75 μg/kg，實(shí)驗(yàn)組中NDMA含量為3.78 μg/kg），說明本研究所得到的模型與實(shí)際擬合程度較好，通過正交試驗(yàn)所確定的最佳亞硝化抑制劑配比合理可行。

3 結(jié) 論

采用四因素二次回歸正交組合方法，建立NDMA抑制率與茶多酚、迷迭香、VE、VC配比的二次回歸方程，根據(jù)方程得到4 種抑制劑的最佳配比。結(jié)果表明：當(dāng)茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L時(shí)，可以得到理論上最高的NDMA抑制率47.16%；將此水平的抑制劑分別加入到模擬體系以及魚糜制品（魚豆腐）中，得出NDMA的抑制率分別為45.32%和44.00%，說明得到的回歸模型與實(shí)際擬合效果較好；且由NDMA回歸模型分析可得，茶多酚和迷迭香對(duì)NDMA抑制率的影響較顯著。此回歸模型為肉制品加工中N-亞硝胺抑制劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)依據(jù)，為降低肉制品加工過程中N-亞硝胺的形成提供技術(shù)支撐，為實(shí)際生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。