李林賢，李詩義，諸曉旭，寧 誠，周存六*

（合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009）

保水性、蒸煮損失率和質構是肉制品重要的品質特性，取決于肌肉中鹽溶蛋白的凝膠特性[1]。肉制品的實際加工過程涉及鹽溶蛋白從肌肉組織中的溶出及其隨后的凝膠化[2]。但是，鹽溶蛋白通常不溶于水或低離子強度的緩沖溶液，而溶于中等或高離子強度的緩沖溶液[3]。因此，目前肉制品的加工主要利用NaCl協同復合磷酸鹽增加鹽溶蛋白的溶解度[4-5]。過量攝入NaCl和磷酸鹽可能對人體健康存在潛在威脅[6-7]，因此低鈉、低磷肉制品是肉類工業(yè)發(fā)展的重要方向。然而，減少NaCl和磷酸鹽的使用量不利于肉制品的保水和質構特性[6-8]，不利于肉制品的品質。因此，迫切需要開發(fā)一種在低鈉和低磷條件下提高肉制品品質的方法。

L-精氨酸（精氨酸）和L-賴氨酸（賴氨酸）2 種必需氨基酸已在GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中被批準為食品的香精香料，可廣泛應用于食品行業(yè)。近年來，精氨酸和賴氨酸作為天然的食品添加劑引起了肉類行業(yè)的廣泛興趣。Zhou Cunliu[9-10]、Zheng Yadong[11]等研究表明，精氨酸和賴氨酸可以提高低鈉低磷肉制品的保水和質構特性，改善肉制品的色澤和風味。精氨酸和賴氨酸也被證實可以提高低KCl條件下肌球蛋白的溶解度[2,12]，表明精氨酸/賴氨酸的應用可能會促進肌肉組織中鹽溶蛋白的溶出。另外，Qin Hao等[13]研究發(fā)現，精氨酸可以改善已溶出的鹽溶蛋白熱誘導凝膠的保水和質構特性。但是，精氨酸和賴氨酸改善肉制品保水和質構特性的機制尚不明確。

目前，已有一些關于精氨酸/賴氨酸對雞肉香腸保水與質構等特性影響機制的研究報道。但迄今為止，這些報道均集中在精氨酸/賴氨酸對鹽溶蛋白熱凝膠性質影響的研究上。由于鹽溶蛋白的提取需要在一定的離子強度下才能順利進行，因此，這些研究的實驗條件與實際肉制品加工條件有明顯的不同。在低鈉無磷及添加精氨酸/賴氨酸的條件下，肌肉組織中溶出的蛋白是否具有良好的凝膠形成能力？針對上述問題，本研究以1.5 g/100 mL NaCl+0.55 g/100 mL精氨酸/賴氨酸溶液為提取劑，研究雞胸肉蛋白提取物的凝膠特性，探究精氨酸/賴氨酸改善低鈉低磷肉制品保水與質構特性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉（3 批，約10 kg，雞齡約40 d）購自合肥市家樂福超市。

L-精氨酸（食品級，純度99.5%）、L-賴氨酸（食品級，純度99.0%） 上海伊卡生物技術有限公司；氯化鈉、氯化鉀、復合磷酸鹽（六偏磷酸鈉∶三聚磷酸鈉∶焦磷酸鈉=1∶2∶2（m/m））、溴酚藍、甘油十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、戊二醛、冰醋酸、丙酮、鹽酸、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MG-1220絞肉機 佛山市順德區(qū)金儀美電器有限公司；ML104電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；HR-3 Discovery流變儀、Q2000差示掃描量熱儀美國TA儀器公司；FA25高速剪切乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；CT14RD冷凍離心機 杭州紐藍科技有限公司；752N紫外-可見分光光度計 上海儀表公司；JSM6490LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取劑的配制

在肉制品實際加工過程中，向肉糜中添加NaCl和復合磷酸鹽有利于肌原纖維蛋白的提取。為模擬實際加工條件，配制7 種蛋白提取劑（protein extraction solvents，PES）。PES 1：對照組，1.5 g/100 mL NaCl，pH 6.65；PES 2：1.5 g/100 mL NaCl+0.55 g/100 mL精氨酸，pH 10.73；PES 3：1.5 g/100 mL NaCl+0.55 g/100 mL賴氨酸，pH 10.04；PES 4：1.5 g/100 mL NaCl+0.5 g/100 mL復合磷酸鹽，pH 9.38。

考慮到pH值是影響蛋白提取的重要因素，設置2 個pH值對照組。將1.5 g/100 mL NaCl溶液的pH值分別調至與精氨酸和賴氨酸單獨添加組相同，即PES 5：1.5 g/100 mL NaCl，pH 10.73；PES 6：1.5 g/100 mL NaCl，pH 10.04。此外，參考GB 2760—2014中規(guī)定的同類產品中NaCl與復合磷酸鹽的使用量，另設置PES 7：2.5 g/100 mL NaCl+0.5 g/100 mL復合磷酸鹽，pH 9.31。

1.3.2 蛋白提取

將雞胸肉去除皮、結締組織、脂肪等，剩下的肉用內徑5 mm篩孔的MGB-120絞肉機絞碎，此操作重復2 次；將絞碎的肉糜分裝并貯藏在－18 ℃，備用。所有操作均在4 ℃條件下進行。

向60 g雞胸肉肉糜中加入300 mL蛋白提取劑，于組織搗碎機中搗碎，然后在10 000 r/min條件下進行均質乳化，重復3 次，每次20 s；于4 ℃冰箱中平衡過夜，用3 層紗布過濾，除去結締組織和脂肪，利用GL-21M高速離心機在14 000×g條件下離心20 min，上清液即為蛋白提取物。

將用蛋白提取劑PES 1～7提取所得的蛋白提取物分別命名為PE 1、PE 2、PE 3、PE 4、PE 5、PE 6和PE 7，用于后續(xù)的理化性質與熱誘導凝膠特性分析。在提取后，立即對蛋白提取物進行pH值測定[9]，采用雙縮脲法測定濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法進行蛋白成分分析[14]。

1.3.3 凝膠制備

參照Chen Xing等[15]的方法制備凝膠，并略作修改。將10 mL蛋白提取物置于10 mL燒杯（內徑25 mm，高度35 mm）中，從20 ℃升溫至80 ℃，并在80 ℃條件下水浴30 min，之后立即冰浴冷卻，然后在4 ℃冰箱中貯藏12 h以供后續(xù)研究。

蛋白提取物PE 1～7所形成的蛋白凝膠（protein gel，PG）相應地命名為PG 1、PG 2、PG 3、PG 4、PG 5、PG 6和PG 7。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 pH值

參照Zhou Cunliu等[9]的方法。每個樣品測定3 次，取平均值。

1.3.4.2 蛋白熱特性

參照Zhou Cunliu等[10]的方法，并稍作修改。采用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）進行檢測，起始溫度設置為20 ℃，終止溫度設置為85 ℃，以3 ℃/min的速率升溫，并于20 ℃條件下平衡5 min，收集其熱相變溫度點Tm。重復測定3 次。

1.3.4.3 混合體系流變特性

參照Qin Hao等[13]的方法，并略作修改。測試采用振蕩模式，選用60 mm平行板，500 μm空隙，頻率0.796 Hz；升溫過程參數：由20 ℃升溫至80 ℃，升溫速率2 ℃/min；降溫過程參數：由80 ℃降溫至20 ℃，降溫速率4 ℃/min。重復測定3 次。

1.3.4.4 保水性與蒸煮損失

參照Ma Fei等[16]的方法，均重復測定3 次。

1.3.4.5 凝膠強度

采用TA-XT Plus物性儀測定蛋白凝膠的強度[15]。選用GMIA模式，參數設定如下：探頭型號P/0.5，測前速率1.5 mm/s，測中速率l.0 mm/s，測后速率l.0 mm/s，間隔時間5 s，觸發(fā)力5 g，下壓距離4 mm，樣品壓縮程度35%，觸發(fā)類型Strain，凝膠強度單位g。實驗重復3 次。

應該指出的是，在測定動態(tài)流變、熱特性以及凝膠化之前再次用0.5 mol/L的KOH溶液將PE 5、PE 6的pH值分別調至與PE 2、PE 3相同，以排除pH值對上述蛋白提取物的理化性質以及熱誘導凝膠特性的影響。

1.3.4.6 凝膠微觀結構

參照Chen Xing等[8]的方法，并略作修改。將待測的蛋白凝膠樣品切成5 mm×5 mm×2 mm的薄片，浸入4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（二者體積比1∶1）中固定2 h；用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗10 次，然后分別選用體積分數為30%、50%、70%、85%和100%的乙醇溶液進行梯度脫水，每個梯度脫水10 min；最后用無水丙酮溶液脫水，脫水完成的凝膠于真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h。噴金，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察。

1.4 數據處理

使用Excel 2003軟件進行數據處理，實驗數據表示為平均值±標準差；并用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析進行數據的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著；采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白提取物的理化性質

經測定，蛋白提取物PE 1的蛋白質量濃度為16.07 g/mL，PE 2、3、4、7的蛋白含量明顯高于PE 1，表明向1.5 g/100 mL NaCl溶液中添加精氨酸、賴氨酸和復合磷酸鹽能夠促進蛋白從肌肉組織中溶出。SDS-PAGE結果表明：對于PE 1，在分子質量分別為100、60、50、45、35、28 kDa處發(fā)現蛋白條帶，與肌漿蛋白的化學成分基本一致[17-20]；而PE 2、3、4、7在分子質量分別為15、25、200 kDa處均出現了1 條清晰的寬帶，在分子質量為45 kDa處條帶加深，表明精氨酸、賴氨酸和復合磷酸鹽有利于鹽溶蛋白的提取。PE 5、6的蛋白含量和SDS-PAGE結果與PE 1基本一致，表明pH值對肌原纖維蛋白的提取沒有明顯的促進作用。

2.1.1 蛋白提取物的熱特性

熱變性溫度點（Tm）的變化是衡量蛋白天然結構遭到破壞的一個重要指標，反映了蛋白提取物的化學變化[21]。

圖1 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白提取物熱特性的影響Fig. 1 Effects of Arg/Lys and phosphates on thermal properties of protein extracts

表 1 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白提取物Tm的影響Table 1 Effects of Arg/Lys and phosphates on the Tm of protein extracts℃

由圖1和表1可知，不同組樣品之間的Tm存在明顯差異。對照組樣品僅在60.55 ℃處有1 個明顯的特征峰；而PE 2、3、4、7在46.91～44.28 、54.84～60.35、66.26～72.97 ℃處有3 個明顯的特征峰，明顯不同于對照組；PE 5、6在59.54～60.01 ℃處顯示出單一的特征峰，伴隨著72.52～73.64 ℃處1 個肩峰。同樣地，Qin Hao[13]、Lei Zhen[22]等也分別在雞鹽溶蛋白和雞肌動球蛋白中觀察到3 個明顯的特征峰。

鹽溶蛋白的第1個轉變峰（Tm1）可能代表肌球蛋白頭部熱變性，第2個轉變峰（Tm2）可能代表肌球蛋白尾部和/或肌漿蛋白熱變性，第3個轉變峰（Tm3）可能代表肌動蛋白變性[23-24]。因此，如上所述，對照組樣品的肌球蛋白、肌動蛋白含量較少，唯一的特征峰最有可能是肌漿蛋白變性引起的。PE 2、3、4、7出現的Tm1、Tm2和Tm3可能分別歸因于肌球蛋白頭部、肌球蛋白尾部和/或肌漿蛋白以及肌動蛋白的變性。這一結果也進一步表明，將精氨酸/賴氨酸或復合磷酸鹽加入到1.5 g/100 mL NaCl溶液中能夠有效促進鹽溶蛋白的提取。根據SDS-PAGE圖譜，PE 5、6出現的肩峰最有可能是由于肌動蛋白的變性引起的。DSC結果的差異性表明蛋白成分不同，因而導致加熱過程中發(fā)生了不同的化學變化。

與PE 4、7相比，PE 2、3的Tm1向更高的溫度方向移動，表明PE 2、3肌球蛋白頭部的變性溫度增加。Tm1反映巰基通過有限的氧化向二硫鍵的轉變[25]。精氨酸/賴氨酸具有抗氧化能力[7,26]，這可能是導致Tm1升高的原因。PE 2、3與PE 4、7 Tm1、Tm2及Tm3的不同表明PE 2、3可能形成了與PE 4、7不同結構的熱誘導凝膠。另外，PE 2、3的Tm2和Tm3比PE 4更高（P＜0.05），表明PE 2、3的肌球蛋白尾部和/或肌漿蛋白以及肌動蛋白的變性需要在更高的溫度下完成。Schneider等[27]研究發(fā)現，精氨酸與蛋白有弱的結合能力，能夠增加聚集的活化能。因此，推測精氨酸/賴氨酸帶有的胍基或ε-氨基基團與蛋白的結合可能是導致更高的Tm2和Tm3的原因。

2.1.2 蛋白提取物的動態(tài)流變特性

圖2 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白升溫和降溫過程中儲能模量的影響Fig. 2 Effects of Arg/Lys and phosphates on the storage modulus of protein extracts during heating and cooling

儲能模量（G0）與彈性相關，可以反映凝膠的強度[28]。由圖2A可知，在加熱過程中，PE 2、3、4、7中出現了4 個典型的溫度區(qū)間。Qin Hao[13]、Lei Zhen[22]等也分別在雞鹽溶蛋白和雞肌動球蛋白中觀察到類似的典型溫度區(qū)間。從20 ℃到46 ℃，G0基本保持不變；但在大約46 ℃時開始急劇上升，52 ℃時達到峰值，這可能由于第2個溫度區(qū)間涉及二硫鍵的形成，致使黏性溶液向彈性網絡轉變，為凝膠網絡形成的初始階段[25]；G0在52～60 ℃范圍內急劇下降，這可能是由于肌球蛋白的螺旋結構向卷曲轉化，導致分子“流動性”增強[23,29]；在60～80 ℃的溫度范圍內，G0再次顯著增加，這可能是由于蛋白質之間的交聯增加，形成牢固且不可逆的凝膠。

由圖2A可知，PE 2、3、4、7的動態(tài)流變特性與PE 1、5、6明顯不同。在第1個溫度范圍內，PE 2、3，特別是PE 4、7的G0高于PE 1、5、6（P＜0.05），表明PE 2、3，特別是PE 4、7具有更高的凝膠強度，這可能是由于PE 2、3，特別是PE 4、7較高的蛋白濃度。這表明，PE 2、3、4、7在加熱過程中具有良好的凝膠形成能力。然而，在加熱過程中，PE 1、5、6的G0沒有明顯變化，這可能是由于PE 1、5、6中鹽溶蛋白的濃度較低。同時，PE 1、5、6沒有出現4 個典型的溫度區(qū)間，也表明其在加熱過程中可能具有較弱的形成三維網絡結構的能力。

PE 2、3、4、7之間的動態(tài)流變曲線也存在一些差異。首先，與PE 4、7在50 ℃達到第1個峰值相比，PE 2、3在較高溫度（52 ℃）下達到第1個峰值。這一結果表明，由于精氨酸和賴氨酸具有抗氧化作用，精氨酸或賴氨酸的添加可能會延緩肌球蛋白頭部的聚集[7,26]。其次，在第2、3、4個溫度區(qū)間內以及冷卻過程中，PE 4特別是PE 7具有比PE 2、3更高的G0，表明PE 4特別是PE 7具有比PE 2、3更好的膠凝能力。此外，在后3 個溫度范圍內，PE 7的G0比PE 4高，表明在一定范圍內離子強度的增加可能有利于蛋白凝膠的形成。

由圖2B可知，在冷卻過程中，PE 2、3、4、7的G0顯著增加，PE1、5、6的G0增加依然不顯著，冷卻過程中G0的增加表明凝膠強度進一步加強。

2.2 蛋白提取物的凝膠性質

2.2.1 保水性和蒸煮損失測定結果

保水性和蒸煮損失可以衡量蛋白凝膠結合水的能力，通常用于客觀反映肉類和肉制品的品質和產量[30]。

圖3 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白凝膠保水性的影響Fig. 3 Effects of Arg/Lys and phosphates on the WHC of various gels

圖4 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白凝膠蒸煮損失的影響Fig. 4 Effects of Arg/Lys and phosphates on the CL of various gels

由圖3～4可知，PG 2、3，特別是PG 4、7的保水性顯著高于PG 1、5、6（P＜0.05），表明PG 2、3、4、7具有更強的保水能力。這可能與PE 2、3、4、7中較高的蛋白濃度，特別是較高的肌球蛋白等鹽溶蛋白濃度有關。另一方面，PE 2、3、4、7具有良好的形成三維網絡凝膠的能力，這可能有利于保持流動狀態(tài)的水分，最終導致凝膠的保水性增加，蒸煮損失減少?？紤]到在加熱前PG 2與PG 5具有相同的pH值，PG 3與PG 6具有相同的pH值，因此在精氨酸/賴氨酸存在條件下，pH值不是引起凝膠保水性增加和蒸煮損失降低的主要原因。PG 2、3的保水性和蒸煮損失顯著低于PG 4、7（P＜0.05），這可能是由凝膠微觀結構的差異導致的。

2.2.2 凝膠強度測定結果

圖5 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白凝膠強度的影響Fig. 5 Effects of Arg/Lys and phosphates on the strength of various gels

凝膠強度是表征蛋白凝膠性質的另一個重要特征。由圖5可知，PG 2、3，尤其是PG 4、7的凝膠強度顯著高于PG 1、5、6（P＜0.05）。此外，PG 4、7具有比PG 2、3更高的凝膠強度（P＜0.05），這可能與較高的肌球蛋白等鹽溶蛋白濃度以及蛋白溶液的pH值更接近蛋白膠凝的最佳pH值（約6.3）有關[31]。PE 1具有與PE 5、6幾乎相同的蛋白濃度，但是其凝膠強度顯著高于PG 5、6（P＜0.05），這可能是由于與PE 5、6相比，PE 1的pH值更接近鹽溶蛋白凝膠化的最佳pH值（約6.3）。這一結果與上文中關于動態(tài)流變學特征的描述一致。

2.2.3 凝膠的微觀結構測定結果

保水性及凝膠質構特性都與凝膠的微觀結構有關[8,13]。由于PE 1、5、6的凝膠強度非常弱，預處理不能順利進行，因此不能進行SEM分析。

圖6 精氨酸/賴氨酸與復合磷酸鹽對蛋白凝膠微觀結構的影響Fig. 6 Effects of Arg/Lys and phosphates on themicrostructure of various gels

由圖6可知，PG 2、3、4、7均明顯觀察到連續(xù)的三維網絡結構，表明它們均具有較好的凝膠形成能力，這與蛋白提取物的動態(tài)流變學描述是一致的。另外，PG 2、3形成的凝膠網絡結構具有稍大的洞穴，而PG 4、7顯示出更加均勻、致密的三維網絡凝膠結構，這為PG 4、7具有比PG 2、3更高的持水力和凝膠強度提供了一個合理的解釋。

與對照組相比，PG 2、3形成了連續(xù)的三維網絡凝膠結構?；谀壳暗难芯拷Y果，可以得出結論：0.55 g/100 mL精氨酸/賴氨酸促進了雞胸肉中鹽溶蛋白的提取，使蛋白提取物具有良好的形成連續(xù)三維網絡凝膠的能力，最終導致所形成的凝膠具有較低的蒸煮損失、較高的持水力和凝膠強度。目前的研究結果有助于理解精氨酸/賴氨酸在提高肉制品產量和品質等方面的作用機制。

3 結 論

與對照組相比，0.55 g/100 mL精氨酸/賴氨酸添加組相應的蛋白提取物的DSC結果表明，出現3 個特征變形峰，動態(tài)流變呈現典型的4 個明顯的溫度區(qū)間，所形成的蛋白凝膠具有更好的保水能力和凝膠強度。本研究結果有助于了解精氨酸/賴氨酸提高肉制品保水和質構特性的作用機制。